О возможности использования флуоресцентного зонда на основе ацедана для регистрации сульфида водорода (H₂S) в клетках первичных нейрональных культур

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Сероводород (сульфид водорода, H₂S), который при физиологических условиях существует в клетках преимущественно в форме аниона HS-, рассматривают в качестве газообразного трансмиттера меж- и внутриклеточных сигналов наравне с монооксидами азота и углерода. Анализ динамики содержания H₂S в живых клетках невозможен без создания чувствительных и специфичных зондов. Группой K.H. Ahn было синтезировано несколько соединений на основе ацедана (acedan), которые в присутствии H₂S присоединяли сульфгидрильную группу, образуя флуоресцирующие карбоциклические соединения. По спектральным характеристикам и скорости реагирования с H₂S оптимальным оказалось вещество P3, образующее карбоциклические соединение csP3, которое обладает таким же большим смещением Стокса, как P3 (~130 нм), но имеет более яркую флуоресценцию. В данной работе проверили пригодность csP3 для регистрации изменений H₂S в растворах, имитирующих минимальный солевой состав внутриклеточный среды, а также в клетках первичной нейрональной культуры из коры головного мозга крысы. Обнаружено, что интенсивность флуоресценции csP3, который образуется при добавлении Na₂S (донора H₂S, 100 и 300 мкМ) к раствору P3, различается для растворов, соответствующих по солевому составу внеклеточной среде и цитозолю. В обоих случаях флуоресценция увеличивается в присутствии бикарбоната (NaHCO₃, 10 мM). Снижение полярности растворов за счет добавления диметилсульфоксида (30% по объему) сдвигало эмиссию на ~10 нм в коротковолновую область и вдвое увеличивало интенсивность. Глутамат (10 мкМ, в присутствии 10 мкМ глицина, 0 Mg2+) увеличивал флуоресценцию зонда, но только в тех нейронах, в которых не возникла отсроченная дерегуляция кальциевого гомеостаза. Добавление к клеточной культуре P3 или csP3 вызывало быстрое увеличение флуоресцентного сигнала, который через 3–5 мин сменялся медленным ростом сигнала. Сделан вывод, что продукт реакции P3 с H₂S чувствителен к изменению солевого состава внутриклеточной среды и может перераспределяется в клетках между водным и более гидрофобным окружением. Эти обстоятельства затрудняют интерпретацию роста флуоресценции P3 в клетках как количественного показателя наличия H₂S и требуют дополнительных исследований свойств этого и структурно родственных зондов H₂S.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Р. Р. Шарипов

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Email: surin_am@mail.ru
Россия, Москва, 125315

И. А. Таржанов

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: surin_am@mail.ru
Россия, Москва, 119296; Москва, 119435

А. А. Згодова

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: surin_am@mail.ru
Россия, Москва, 119296; Москва, 119435

З. В. Бакаева

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Минздрава России; Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова

Email: surin_am@mail.ru
Россия, Москва, 119296; Элиста, 358000

А. М. Сурин

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: surin_am@mail.ru
Россия, Москва, 125315

Список литературы

  1. Singha S., Kim D., Moon H., Wang T., Kim K.H., Shin Y.H., Jung J., Seo E., Lee S.J., Ahn K.H. 2015. Toward a selective, sensitive, fast-responsive, and biocompatible two-photon probe for hydrogen sulfide in live cells. Anal. Chem. 87 (2), 1188–1195.
  2. Wang R. 2002. Two’s company, three’s a crowd: Can H₂S be the third endogenous gaseous transmitter? FASEB J. 16 (13), 1792–1798.
  3. Li Q., Lancaster J.R. 2013. Chemical foundations of hydrogen sulfide biology. Nitric Oxide. 35, 21–34.
  4. Гусакова С.В., Ковалев И.В., Смаглий Л.В., Бирулина Ю.Г., Носарев А.В., Петрова И.В., Медведев М.А., Орлов С.Н., Реутов В.П. 2015. Газовая сигнализация в клетках млекопитающих. Успехи физиол. наук. 46 (4), 53–73.
  5. Сукманский О.И., Реутов В.П. 2016. Газотрансмиттеры: физиологическая роль и участие в патогенезе заболеваний. Успехи физиол. наук. 47 (3), 30–58.
  6. Reutov V.P., Sorokina E.G, Sukmansky O.I. 2020. Cycles of nitric oxide (NO), superoxide radical anion (•O2–) and hydrogen sulfur/sulfur dioxide (H₂S/SO2) in mammals. Current Res. Biopolymers, 3, 1.
  7. Wang R. 2010. Hydrogen sulfide: The third gasotransmitter in biology and medicine. Antioxid. Redox Signal, 12 (9), 1061–1064.
  8. Kimura H. 2010. Hydrogen sulfide: From brain to gut. Antioxid. Redox Signal. 12 (9), 1111–1123.
  9. Kimura H. 2020. Hydrogen sulfide signalling in the CNS – Comparison with NO. Br.J. Pharmacol. 177 (22), 5031–5045.
  10. Kumar M., Sandhir R. 2018. Hydrogen sulfide in physiological and pathological mechanisms in brain. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 17 (9), 654–670.
  11. Zhong H., Yu H., Chen J., Sun J., Guo L., Huang P., Zhong Y. 2020. Hydrogen sulfide and endoplasmic reticulum stress: A potential therapeutic target for central nervous system degeneration diseases. Front. Pharmacol. 11, 702. doi: 10.3389/fphar.2020.00702.
  12. Salehpour M., Ashabi G., Kashef M., Marashi E.S., Ghasemi T. 2023. Aerobic training with naringin supplementation improved spatial cognition via H₂S signaling pathway in Alzheimer’s disease model rats. Exp. Aging Res. 49 (4), 407–420.
  13. Sun P., Chen H.C., Lu S., Hai J., Guo W., Jing Y.H., Wang B. 2022. Simultaneous sensing of H₂S and ATP with a two-photon fluorescent probe in Alzheimer’s disease: Toward understanding why H₂S regulates glutamate-induced ATP dysregulation. Anal. Chem. 94 (33), 11573–11581.
  14. Wang S., Huang Y., Guan X. 2021. Fluorescent probes for live cell thiol detection. Molecules. 26 (12).
  15. Chen S., Hou P., Wang J., Fu S., Liu L. 2018. A rapid and selective fluorescent probe with a large Stokes shift for the detection of hydrogen sulfide. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 203, 258–262.
  16. Chen X., Huang Z., Huang L., Shen Q., Yang N. Di, Pu C., Shao J., Li L., Yu C., Huang W. 2022. Small-molecule fluorescent probes based on covalent assembly strategy for chemoselective bioimaging. RSC Adv. 12 (3), 1393–1415.
  17. Yan L., Gu Q.S., Jiang W.L., Tan M., Tan Z.K., Mao G.J., Xu F., Li C.Y. 2022. Near-infrared fluorescent probe with large stokes shift for imaging of hydrogen sulfide in tumor-bearing mice. Anal. Chem. 94 (14), 5514–5520.
  18. Singha S., Kim D., Roy B., Sambasivan S., Moon H., Rao A.S., Kim J.Y., Joo T., Park J.W., Rhee Y.M., Wang T., Kim K.H., Shin Y.H., Jung J., Ahn K.H. 2015. A structural remedy toward bright dipolar fluorophores in aqueous media. Chem. Sci. 6 (7), 4335–4342.
  19. Safiulina D., Kaasik A., Seppet E., Peet N., Zharkovsky A., Seppet E. 2004. Method for in situ detection of the mitochondrial function in neurons. J. Neurosci. Methods. 137 (1), 87–95.
  20. Kolikova J., Afzalov R., Surin A., Lehesjoki A.E., Khiroug L. 2011. Deficient mitochondrial Ca²⁺ buffering in the Cln8(mnd) mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis. Cell Calcium. 50 (6), 491–501.
  21. Бакаева З.В., Сурин А.М., Лизунова Н.В., Згодова А.Е., Красильникова И.А., Фисенко А.П., Фролов Д.А., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Пинелис В.Г. 2020. Нейропротекторный потенциал пептидов HFRWPGP (ACTH 6–9 PGP), KKRRPGP, PyrRP в культивируемых корковых нейронах при глутаматной эксайтотоксичности. Докл. РАН. Науки о жизни. 491 (1), 117–121.
  22. Krasil’nikova I., Surin A., Sorokina E., Fisenko A., Boyarkin D., Balyasin M., Demchenko A., Pomytkin I., Pinelis V. 2019. Insulin protects cortical neurons against glutamate excitotoxicity. Front. Neurosci. 13, 1027. doi: 10.3389/fnins.2019.01027.
  23. Liang G.H., Adebiyi A., Leo M.D., McNally E.M., Leffler C.W., Jaggar J.H. 2011. Hydrogen sulfide dilates cerebral arterioles by activating smooth muscle cell plasma membrane KATP channels. Am.J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300 (6), H2088–H2095. doi: 10.1152/ajpheart.01290.2010.
  24. Yoo D., Jupiter R.C., Pankey E.A., Reddy V.G., Edward J.A., Swan K.W., Peak T.C., Mostany R., Kadowitz P.J. 2015. Analysis of cardiovascular responses to the H₂S donors Na₂S and NaHS in the rat. Am.J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 309 (4), H605–H614.
  25. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, с. 194–221.
  26. Vaughan-Jones R.D., Spitzer K.W. 2002. Role of bicarbonate in the regulation of intracellular pH in the mammalian ventricular myocyte. Biochem. Cell Biol. 80 (5), 579–596.
  27. Khodorov B. 2004. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog. Biophys. Mol. Biol. 86 (2), 279–351.
  28. Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Пинелис В.Г., Горбачева Л.Р., Сурин А.М. 2018. Исследование механизма сенситизации нейронов к повторному действию глутамата. Биол. мембраны. 35 (5), 384–397.
  29. Kiedrowski L. 1999. N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: Relationships among plasma membrane potential, Na+/Ca²⁺ exchange, mitochondrial Ca²⁺ overload, and cytoplasmic concentrations of Ca²⁺, H+, and K⁺. Mol. Pharmacol. 56 (3), 619–632.
  30. Nicholls D.G., Budd S.L. 2000. Mitochondria and neuronal survival. Physiol. Rev. 80 (1), 315–360.
  31. Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Szabadkai G., Pinelis V.G., Brustovetsky N., Rizzuto R., Khodorov B.I. 2008. Measurements of mitochondrial pH in cultured cortical neurons clarify contribution of mitochondrial pore to the mechanism of glutamate-induced delayed Ca²⁺ deregulation. Cell Calcium. 43 (6), 602–614.
  32. Сурин А.М., Красильникова И.А., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. 2014. Исследование взаимосвязи между индуцированной глутаматом отсроченной Ca²⁺-диcрегуляцией, митохондриальной деполяризацией и последующей гибелью нейронов. Патогенез. 12 (4), 40–46.
  33. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Пинелис В.Г. 2022. Изменения pH в матриксе митохондрий и цитозоле при индуцированной глутаматом диcрегуляции Cа2+-гомеостаза в культивируемых нейронах гиппокампа крысы. Биол. мембраны. 39 (4), 307–318.
  34. Efremov Y.M. Yu.M., Grebenik E.A., Sharipov R.R., Krasilnikova I.A., Kotova S.L., Akovantseva A.A., Bakaeva Z.V., Pinelis V.G., Surin A.M., Timashev P.S. 2020. Viscoelasticity and volume of cortical neurons under glutamate excitotoxicity and osmotic challenges. Biophys. J. 119 (9), 1712–1723.
  35. Yao L., Yin C., Huo F. 2022. Small-molecule fluorescent probes for detecting several abnormally expressed substances in tumors. Micromachines (Basel). 13, 1328. https://doi.org/10.3390/mi13081328
  36. Vitvitsky V., Kumar R., Libiad M., Maebius A., Landry A.P., Banerjee R. 2021. The mitochondrial NADH pool is involved in hydrogen sulfide signaling and stimulation of aerobic glycolysis. J. Biol. Chem., 296, 100736–100750.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структура слабо флуоресцирующего соединения P3 и сильно флуоресцирующего продукта его взаимодействия с сульфидом водорода и сульфид-ионом в водном растворе (заимствовано с изменениями из [1]).

Скачать (68KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Изменения флуоресценции, вызванные добавкой сульфида натрия (Na₂S, 100 мкМ), служащего донором H₂S, к раствору P3 (10 мкМ). Состав минимального солевого раствора (мM): 130 NaCl, 5 KCl, 20 HEPES, 2 CaCl2, 1 MgCl₂, рН 7.4. Длины волн возбуждения (Ex) и регистрации флуоресценции (Em) соответственно 380 ± 8 и 510 ± 10 нм. Концентрации P3 и Na₂S соответственно 10 и 100 мкМ.

Скачать (114KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Спектры флуоресценции исходного P3, его карбоциклического сульфгидрильного производного (csP3), образовавшегося при добавлении Na₂S, и влияние полярности среды на флуоресценцию P3 и csP3. Спектры записаны через 20 мин после смешения P3 с Na₂S. Концентрации реагентов и состав раствора как на рис. 2. Спектры P3+DMSO и csP3+DMSO получены после добавления к соответствующим растворам DMSO (30% по объему). Длина волны возбуждения флуоресценции 380±8 нм.

Скачать (135KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Влияние солевого состава раствора на флуоресценцию H₂S-зонда csP3. Флуоресценция csP3 в растворе, приближенном по составу солей к внеклеточной среде (а) и к минимальному солевому составу цитозоля (в), и влияние бикарбоната натрия (NaHCO₃, 10 мM) на флуоресценцию csP3 во внеклеточном (б) и внутриклеточном (г) растворах. Составы растворов и рН указаны в “Материалах и методах”. Условия регистрации флуоресценции как на рис. 2.

Скачать (313KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Флуоресценция производного P3 в области ядра существенно ниже, чем в области цитозоля. а, б – Изображения нейронов при возбуждении при 387 нм и регистрации эмиссии при 483±16 (а) и 520±18 нм (б); получены через 23 мин после добавления P3. На изображениях выделены ROI, кинетика изменений интенсивности которых приведена на графиках в, д. Изменения в области ядра обозначены синим цветом, в области цитозоля – красным. На панелях г, е сопоставлены интенсивности (левые шкалы) и отношения интенсивностей (правые шкалы) в цитоплазме и ядре при регистрации сигналов при 483 и 520 нм (соответственно “Отношение 483 цитозоль/ядро” и “Отношение 520 цитозоль/ядро”) через 23 мин после добавления P3. Интенсивность флуоресценции на всех графиках представлена после вычета фона. Объектив 40×/NA=1.35 oil.

Скачать (633KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Изменения [Ca²⁺]i и флуоресцентных сигналов H₂S-зонда P3 в соме клеток при действии глутамата (Glu). а, б – Изменения [Ca²⁺]i, в, г, д – изменения сигналов P3/csP3, е – изменения относительных наклонов графиков флуоресценции P3/csP3 (нормализованные углы наклона), вызванные добавлением глутамата, в нейронах имевших (+ОКД) и не имевших (–ОКД) отсроченную кальциевую дерегуляцию. На панелях а–г показаны результаты одного из трех аналогичных экспериментов. На панели е представлены данные всех трех экспериментов. Относительные наклоны (Sa/Sb) определяли как тангенсы углов наклона коротких линейных фрагментов сигналов P3 индивидуальных нейронов, полученные за 3 мин до (Sb) и в течение первых 3 мин после (Sa) добавления Glu. Измерения [Ca²⁺]i выполнены с помощью XRhod-5F (возбуждение 578±10, эмиссия 641±37 нм). Глутамат (Glu, 10 мкМ) добавляли в безмагниевом растворе, содержащем 10 мкМ глицина. Возраст культуры 9 дней.

Скачать (570KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024