Получение делетированного варианта рекомбинантного флагеллина и исследование его радиозащитной эффективности на модели острого радиационного поражения у мышей

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Цель работы – экспериментальное изучение радиозащитного действия рекомбинантного флагеллина, лишенного антигенных свойств, в условиях общего внешнего облучения мышей по показателям выживаемости и влиянию на гемо- и иммунопоэз. В работе использовано новое рекомбинантное производное флагеллина Salmonella enterica – белок dFliC, полученный путем структурно-ориентированного реинжиниринга ранее разработанной молекулы. Радиозащитное действие dFliC изучали на модели костномозговой формы острого радиационного поражения у мышей. 30-суточную выживаемость облученных мышей анализировали по методу Каплана–Мейера. Оценивали влияние белка dFliC на численность селезеночных колониеобразующих единиц (КОЕ-с) и миелокариоцитов в костном мозге, клеточный состав и цитокиновый профиль периферической крови мышей. Для статистической обработки результатов использовали программное обеспечение Statistica 8.0. Разработан протокол очистки молекулы рекомбинантного флагеллина dFliC и получены образцы белка, чистота которого составила 92.79%. Установлено, что введение dFliC в дозе 1 мг/кг за 15–30 мин до облучения в дозе 7.8 Гр повышало 30-суточную выживаемость мышей на 38% (р < 0.05). Применение dFliC способствовало повышению количества КОЕ-с на 9 сутки после облучения в дозе 7 Гр в 2.8 раза (р < 0.05), сохранению жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, снижению тяжести тромбоцитопении. Регистрировалось повышение продукции ИЛ-3 и ГМ-КСФ, участвующих в регуляции ранних этапов развития кроветворных клеток, и хемоаттрактанта макрофагов ИЛ-12р40; содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-33 поддерживалось на более низком уровне, чем при облучении без применения dFliC. Структурная перестройка молекулы флагеллина не привела к снижению радиозащитного действия рекомбинантного белка. Показано, что противолучевая эффективность dFliC обеспечивается защитным действием на кроветворные клетки костного мозга и стимуляцией постлучевого восстановления гемо- и иммунопоэза путем регуляции экспрессии цитокинов с широким спектром биологической активности.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Елена Викторовна Мурзина

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: elenmurzina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7052-3665
Россия, Санкт-Петербург

Генрих Александрович Софронов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: gasofronov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8587-1328
Россия, Санкт-Петербург

Андрей Семенович Симбирцев

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: simbas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8228-4240
Россия, Санкт-Петербург

Наталия Владимировна Аксенова

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: nataaks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5645-7072
Россия, Санкт-Петербург

Николай Анатольевич Климов

Институт экспериментальной медицины

Email: nklimov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5243-8085
Россия, Санкт-Петербург

Ольга Михайловна Веселова

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: veselova28@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-9345-1845
Россия, Санкт-Петербург

Елена Владимировна Дмитриева

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: ev.dmitrieva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6514-7837
Россия, Санкт-Петербург

Владимир Владиславович Копать

ООО “АТГ Сервис Ген”

Email: kopat@service-gene.ru
ORCID iD: 0000-0002-6573-6743
Россия, Санкт-Петербург

Анастасия Андреевна Рябченкова

ООО “АТГ Сервис Ген”

Email: riabchenkova@service-gene.ru
ORCID iD: 0000-0002-9973-0753
Россия, Санкт-Петербург

Евгений Леонидович Чирак

ООО “АТГ Сервис Ген”

Email: chirak.evgenii@service-gene.ru
ORCID iD: 0000-0001-9167-5000
Россия, Санкт-Петербург

Елизавета Романовна Чирак

ООО “АТГ Сервис Ген”

Email: chirak.elizaveta@service-gene.ru
ORCID iD: 0000-0002-1610-8935
Россия, Санкт-Петербург

Илья Владимирович Духовлинов

ООО “АТГ Сервис Ген”

Email: atg@service-gene.ru
ORCID iD: 0000-0002-5268-9802
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. 1. Tallant T., Deb A., Kar N. et al. A Flagellin acting via TLR5 is the major activator of key signaling pathways leading to NF-kappa B and proinflammatory gene program activation in intestinal epithelial cells. BMC Microbiol. 2004;4:33. https://doi.org/10.1186/1471-2180-4-33
  2. 2. Rhee S.H., Im E., Pothoulakis C. Toll-like receptor 5 engagement modulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human colon cancer. Gastroenterology. 2008;135(2):518–528. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2008.04.022
  3. 3. Singh V.K., Seed T.M. Entolimod as a radiation countermeasure for acute radiation syndrome. Drug Discov. Today. 2021;26(1):17–30. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2020.10.003
  4. 4. Molofsky A.B., Byrne B.G., Whitfeld N.N. et al. Cytosolic recognition of flagellin by mouse macrophages restricts Legionella pneumophila infection. J. Exp. Med. 2006;203(4):1093–1104. https://doi.org/10.1084/jem.20051659
  5. 5. Lai L., Yang G., Yao X., Wang L., Zhan Y., Yu M., Yin R., Li C., Yang X, Ge C. NLRC4 mutation in flagellin-derived peptide CBLB502 ligand-binding domain reduces the inflammatory response but not radioprotective activity. J. Radiat. Res. 2019;60(6):780–785. https://doi.org/10.1093/jrr/rrz062
  6. 6. Biedma M.E., Cayet D., Tabareau J. et al. Recombinant flagellins with deletions in domains D1, D2 and D3: Characterization as novel immunoadjuvants. Vaccine. 2019;37(4):652–663. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.12.009
  7. 7. Malapaka R.R., Adebayo L.O., Tripp B.C. A deletion variant study of the functional role of the Salmonella flagellin hypervariable domain region in motility. J. Mol. Biol. 2007;365(4):1102–1116. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2006.10.054
  8. 8. Mett V., Kurnasov O.V., Bespalov I.A. et al. A deimmunized and pharmacologically optimized Toll-like receptor 5 agonist for therapeutic applications. Commun. Biol. 2021;4(1):466. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01978-6
  9. 9. Rhee J.H., Khim K., Puth S., Choi Y., Lee S.E. Deimmunization of flagellin adjuvant for clinical application. Curr. Opin. Virol. 2023;60:101330. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2023.101330
  10. 10. Zinsli L.V., Stierlin N., Loessner M.J., Schmelcher M. Deimmunization of protein therapeutics – Recent advances in experimental and computational epitope prediction and deletion. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2021;19:315–329. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.12.024
  11. 11. Гребенюк А.Н., Аксенова Н.В., Петров А.В. и др. Получение различных вариантов рекомбинантного флагеллина и оценка их радиозащитной эффективности. Вестн. Рос. воен.-мед. академии. 2013;3:75–80. [Grebenyuk A.N., Aksenova N.V., Petrov A.V. et al. Poluchenie razlichnykh variantov rekombinantnogo flagellina i otsenka ikh radiozashchitnoy effektivnosti = = Preparation of different recombinant flagellin variants and evaluation of their radioprotective efficacy. Vestnik Rossiyskoy Voenno-meditsinskoy akademii. 2013;3:75–80. (In Russ.)].
  12. 12. Мурзина Е.В., Софронов Г.А., Аксенова Н.В. и др. Экспериментальная оценка противолучевой эффективности рекомбинантного флагеллина. Вестн. Рос. воен.-мед. академии. 2017;19(3):122–128. [Murzina E.V., Sofronov G.A., Aksenova N.V. et al. Experimental estimation of the radioprotective efficiency of recombinant flagellin. Vestnik Rossijskoj voenno-medicinskoj akademii. 2017;19(3):122–128. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/brmma623038
  13. 13. Лисина Н.И., Щеголева Р.А., Шлякова Т.Г. и др. Противолучевая эффективность флагеллина в опытах на мышах. Радиац. биология. Радиоэкология. 2019;59(3):274–278. [Lisina N.I., Shchegoleva R.A., Shlyakova T.G. et al. Evaluation of antiradiation efficiency of flagellin in experiments of mice. Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya = = Radiation biology. Radioecology. 2019;59(3):274–278. (In Russ.)]. https://doi.org/10.1134/S086980311903007X
  14. 14. Wang F., Burrage A.M., Postel S. et al. A structural model of flagellar filament switching across multiple bacterial species. Nat. Commun. 2017;8(1):960. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01075-5
  15. 15. Madeira F., Park Y.M., Lee J. et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):636–641. https://doi.org/10.1093/nar/gkz268
  16. 16. Wilkins M.R., Gasteiger E., Bairoch A. et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy Server. Methods Mol. Biol. 1999:112:531–552. https://doi.org/10.1385/1-59259-584-7:531
  17. 17. Yang J., Zhang Y. I-TASSER server: new development for protein structure and function predictions. Nucleic Acids Res. 2015;43(W1):174–181. https://doi.org/10.1093/nar/gkv342
  18. 18. Green M.R., Sambrook J. Transformation of Escherichia coli by electroporation. Cold Spring Harb. Protocols. 2020;2020(6):101220. https://doi.org/10.1101/pdb.prot101220
  19. 19. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0
  20. 20. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Санкт-Петербург: Rus-LASA “НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными”, 2012. 48 с. [Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). Official J. Europ. Union. 2010:33–79. (In Russ.)].
  21. 21. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. 1961. Radiat. Res. 2011;175(2):145–149. https://doi.org/10.1667/rrxx28.1
  22. 22. Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В. и др. Иммунология: практикум. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. 176 с. [Koval’chuk L.V., Ignat’eva G.A., Gankovskaya L.V. i dr. Immunologiya: praktikum = = Immunology: a practical course. Moscow: GEOTAR-Media, 2015. 176 p. (In Russ.)].
  23. 23. Chen X., Zaro J.L., Shen W.C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013;65(10):1357–1369. https://doi.org/10.1016/j.addr.2012.09.039
  24. 24. Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Противолучевые свойства интерлейкина-1. Санкт-Петербург: Фолиант, 2012. 216 с. [Grebenyuk A.N., Legeza V.I. Protivoluchevye svojstva interlejkina-1 = Antiradiation properties of interleukin-1. Sankt-Peterburg: Foliant, 2012. 216 p. (In Russ.)].
  25. 25. Schaue D., Kachikwu E.L., McBride W.H. Cytokines in radiobiological responses: a review. Radiat. Res. 2012;178(6):505–523. https://doi.org/10.1667/RR3031.1
  26. 26. Васин М.В., Соловьев В.Ю., Мальцев В.Н. и др. Первичный радиационный стресс, воспалительная реакция и механизм ранних пострадиационных репаративных процессов в облученных тканях. Мед. радиология и радиац. безопасность. 2018;63(6):71–81. [Vasin M.V., Solov’ev V.Yu., Mal’tsev V.N. et al. Primary radiation stress, inflammatory reaction and the mechanism of early postradiation reparative processes in irradiated tissue. Medical Radiology and Radiation Safety. 2018;63(6):71–81. (In Russ.)]. https://doi.org/10.12737/article_5c0eb50d2316f4.12478307
  27. 27. Рыбкина В.Л., Азизова Т.В., Адамова Г.В., Ослина Д.С. Влияние ионизирующего излучения на цитокиновый статус (обзор литературы). Радиац. биол. Радиоэкология. 2022;62(6):578–590. [Rybkina V.L., Azizova T.V., Adamova G.V., Oslina D.S. Effect of ionizing radiation on cytokine status (Literature review). Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya = = Radiation biology. Radioecology. 2022;62(6):578–590. (In Russ.)]. https://doi.org/10.31857/S086980312206011X
  28. 28. DiCarlo A.L., Horta Z.P., Aldrich J.T. et al. Use of growth factors and other cytokines for treatment of injuries during a radiation public health emergency. Radiat. Res. 2019;192(1):99–120. https://doi.org/10.1667/RR15363.1
  29. 29. Симбирцев А.С., Кетлинский С.А. Перспективы использования цитокинов и индукторов синтеза цитокинов в качестве радиозащитных препаратов. Радиац. биология. Радиоэкология. 2019;59(2):170–176. [Simbirtsev A.S., Ketlinsky S.A. Perspectives for cytokines and cytokine synthesis inducers as radioprotectors. Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya = Radiation biology. Radioecology. 2019;59(2):170–176. (In Russ.)]. https://doi.org/10.1134/S0869803119020164
  30. 30. Легеза В.И., Драчев И.С., Чепур С.В. Осложнения лучевой противоопухолевой терапии (клиника, патогенез, профилактика, лечение). Санкт-Петербург: СпецЛит, 2022. 207 с. [Legeza V.I., Drachev I.S., Chepur S.V. Oslozhneniya luchevoj protivoopuholevoj terapii (klinika, patogenez, profilaktika, lechenie) = Complications of radiation antitumor therapy (clinic, pathogenesis, prevention, treatment). Sankt-Peterburg: SpecLit, 2022. 207 p. (In Russ.)].
  31. 31. Guan R., Pan M., Xu X. et al. Interleukin-33 potentiates TGF-β signaling to regulate intestinal stem cell regeneration after radiation injury. Cell Transplant. 2023;32:9636897231177377. https://doi.org/10.1177/09636897231177377
  32. 32. Пономарев Д.Б., Степанов А.В., Селезнев А.Б., Ивченко Е.В. Ионизирующие излучения и воспалительная реакция. Механизмы формирования и возможные последствия. Радиац. биология. Радиоэкология. 2023;63(3):270–284. [Ponomarev D.B., Stepanov A.V., Seleznyov A.B., Ivchenko E.V. Ionizing radiation and inflammatory reaction. Formation mechanism and implications. Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya = Radiation biology. Radioecology. 2023;63(3):270–284. (In Russ.)]. https://doi.org/10.31857/S0869803123030128

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структура рекомбинантного белка dFliC: А – доменная 3D-структура FliC UniProt ID P06179, полученная с помощью iTASSER, В – доменная структура FliC, С – доменная структура белка dFliC.

Скачать (39KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма результатов хроматографической очистки dFliC методом гидрофобной хроматографии в 12%-ном ПААГ. М – Смесь маркерных фрагментов PageRuler Protein Ladder Plus; 1 – dFliC, фракция, наносимая на колонну (8 мкг); 2 – dFliC, фракция, не связавшаяся с колонной в ходе гидрофобной хроматографии (10 мкл); 3 – dFliC, целевая фракция, полученная в ходе гидрофобной хроматографии (10 мкг).

Скачать (52KB)
Метаданные
4. Рис. 3. ВЭЖХ-анализ образца очищенного рекомбинантного белка dFliC на хроматографе Agilent 1100 с использованием аналитической колонки Jupiter C18, 5 мкм, 46 300 А°, 4,6 × 250 мм (Phenomenex, США). Время удержания: 14.294 мин. Чистота целевого белка: 92.79%.

Скачать (34KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Кривые выживаемости мышей после общего облучения в дозе 7.8 Гр без лечения (Кобл) и профилактического применения флагеллин-содержащих белков (рФЛ и dFliC) в дозе 1 мг/кг или рекомбинантного интерлейкина-1β (ИЛ-1β), 50 мкг/кг. р – значимость отличий с группой “Кобл” (логранговый критерий).

Скачать (47KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Число 9-суточных эндогенных колоний на селезенках мышей после общего облучения в разных дозах без лечения (Контроль) и с применением dFliC в дозе 1 мг/кг, Ме (Q25; Q75). р – значимость отличий с группой “Кобл” (критерий Манна–Уитни).

Скачать (28KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Число ядросодержащих клеток в костном мозге мышей на 9-е сутки после общего облучения без лечения (Контроль) или с профилактическим введением dFliС, Ме (Q25; Q75). * Отличия статистически значимы в сравнении с животными без облучения, р < 0.005; ** то же, р < 0.01 (критерий Манна–Уитни).

Скачать (36KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Содержание тромбоцитов в крови мышей на 9-е сутки после общего облучения без лечения (Контроль) или с профилактическим применением dFliС, Ме (Q25; Q75). * Отличия статистически значимы в сравнении с группой “Контроль без облучения”, р < 0.05; ** – то же, р < 0.005 (критерий Манна–Уитни). Пунктирной линией обозначена нижняя граница физиологической нормы.

Скачать (49KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Содержание цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови интактных мышей (Кбиол) и на 9-е сутки после общего облучения в дозах 7 и 7.8 Гр без лечения или с применением деиммунизированного рекомбинантного флагеллина (dFliС) в дозе 1 мг/кг, Ме (Q25; Q75). * Отличия статистически значимы с группой “Кбиол”, р < 0.05 (критерий Манна–Уитни). Пунктирной линией обозначен предел определения аналита.

Скачать (91KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025