Cytogenetic and molecular studies of different species of raccoon dog (Nyctereutes procyonoides)

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

The raccoon dog (Nyctereutes procyonoides) is recognized as the oldest representative of the family Canidae and represents a distinct branch on the phylogenetic tree. The raccoon dog karyotype contains many segments homologous to chromosomes from the predicted ancestral karyotype for the order. Carnivora were identified. Thus, it was suggested that the raccoon dog has the most primitive karyotype in the family Canidae. Two subspecies are recognized: the Chinese raccoon dog Nyctereutes procyonoi-des procyonoides (N.p.p.) and the Japanese raccoon dog Nyctereutes procyono-des viverrinus (N.p.v.). The karyotype of the Chinese raccoon dog (2n = 54 + B) consists of five pairs of biarmed autosomes and 21 pairs of acrocentric autosomes. The sex chromosomes are also biarmed, with the medium-sized X and Y chromosome being the smallest chromosome in the karyotype. In addition, there is a variable (1–4) number of B chromosomes in this karyotype. A proposal for chromosome nomenclature for the Chinese raccoon dog was recently presented. The karyotype of the Japanese raccoon dog (2n = 38 + B) includes 13 pairs of biarmed chromosomes, 5 pairs of acrocentric chromosomes, and biarmed X and Y chromosomes. This subspecies also has a variable number (2–7) of B chromosomes. Although the karyotypes of both subspecies differ in chromosome number and morphology, they have the same fundamental number of chromosome arms – 66. The raccoon dog has fairly large acrocentric B chromosomes. They differ in size in the two subspecies. In the Chinese raccoon dog, these are medium-sized acrocentrics, while in the Japanese raccoon dog, they are small acrocentrics. Bs are rather positive for C banding; however, the patterns of Cb banding are not as distinct as in autosomal centromeres. R banding has shown that these structures are late replicators.

Texto integral

Енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides Gray) относится к семейству собачьих (Familia Canidae) отряда хищных (Order Carnivora). Род Nyctereutes включает один вид, у которого насчитывают до пяти подвидов. Имеется описание трех подвидов енотовидных собак: N. p. procyonoides (Китай), N. p. ussuriensis (Россия) и N. p. viverrinus (Японские острова).

Цель работы – анализ исследований енотовидных собак различных подвидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведен обзор источников литературы на тему кариосистематики и молекулярной биологии в области изучения енотовидных собак.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитогенетические исследования

О.Г. Вард и другие ученые в 1987 году на основании цитогенетических и палеонтологических исследований сделали вывод, что два подвида Nyctereutes procyonoides произошли от общего материкового предка, японские енотовидные собаки считаются относительно недавней формой. Исследовали родство между подвидами Nyctereutes procyonoides из Китая (2n = 54 + B-хромосомы) и Японии (2n = 38 + B-хромосомы). Хромосомы китайских и японских енотовидных собак сравнивали с помощью обычного окрашивания, нитратом серебра NORs G- и C-полосок. Обширные гомологии G-полосок выявили эволюцию кариотипа путем слияния хромосом. Снижение диплоидного числа у японских енотовидных собак было достигнуто слиянием 16 акроцентрических элементов с образованием восьми метацентрических и субметацентрических. Десять пар аутосом оказались идентичными у этих подвидов и предполагалось, что они произошли от общего предка. Структура G-полос половых хромосом была сходной у двух подвидов, но присутствовали различия при использовании других методов полосования и окрашивания. B-хромосомы находились в разных количествах и размерах у всех исследованных животных, но морфология B-хромосом отличалась у двух подвидов.

B-хромосомы (Bs) от двух видов енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides, Carnivora) были исследованы с помощью микродиссекции сегмента хромосомы и двухцветной FISH. [15] Все они показали гомологию друг с другом, но не с A-хромосомами. Два специфичных для сегмента зонда (из проксимальной и дистальной частей B-хромосомы) были локализованы в соответствующих участках хромосом со значительными различиями в их размерах.

В кариотипах примерно 50 видов животных визуализированы дополнительные хромосомы, названные В-хромосомами. Они распределяются случайным образом, различаются по количеству в клетках и образуют различную конфигурацию во время профазы мейоза. [12] До этого исследования не было доказательств рекомбинации между B-хромосомами. Авторы визуализировали синаптонемные комплексы в пахитенных сперматоцитах, используя антитело против белка аксиального элемента SCP3, и очаги рекомбинации, применяя антитело против белка репарации несоответствия (MLH1), который ассоциируется с узелками поздней рекомбинации в местах хиазмы. С помощью метода FISH со специальными окрашивающими зондами идентифицировали В-хромосомы. В 45 сперматоцитах, полученных от трех самцов китайских енотовидных собак, были обнаружены 2…5 B-хромосом. У трехвалентных количество очагов MLH1 варьирует от 1 до 2, четырехвалентных – от 0 до 3. Полностью парные В-хромосомы, различимые после применения FISH, содержали один очаг MLH1. В 70 сперматоцитах из семенников трех самцов рыжей лисицы были обнаружены B-хромосомы от 1 до 4. Очаги MLH1 наблюдали на двухвалентах (0…1 очаг) и трехвалентах (0…2 очага).

В работе Л.С. Ши с соавторами показано, что диплоидный набор хромосом китайской енотовидной собаки варьирует от 54 (без В-хромосом) до 58 (4 В-хромосомы). В-хромосомы тотально гетерохроматические. Исследование синаптонемных комплексом (СК) было сделано с помощью электронного микроскопа на сперматоцитах этих животных. СК кариотип состоит из 27 регулярных хромосомных пар (аутосомы и половые хромосомы) плюс В-хромосомы. В-хромосомы спариваются эффективно в пахитене, но СК оси В-хромосом намного плотнее, чем другие А-хромосомы. Независимо от числа В-хромосом, наблюдали как биваленты, как и мультиваленты. Когда В-хромосомы представлены в клетке, то вероятно было бы видно параллельное выравнивание всех трех СК. Все мультиваленты показали высокую гомологию среди этих трех гетерохроматических хромосом. Слияние выпуклостей было обнаружено вдоль неспаренных районов всех хромосом, которые оказывались в диплотене.

Семейство Canidae состоит из 36 видов, среди которых есть собаки и три вида одомашненных зверей (песец, рыжая лисица и енотовидная собака). [13, 16] В этом семействе широкий диапазон числа диплоидных хромосом, от 34 + вариабельного числа В-хромосом у рыжей лисицы до 78 у собаки и волка. Интересно, что внутривидовая изменчивость диплоидного числа хромосом существует у песца, рыжей лисицы и енотовидной собаки.

В начале 1990-х годов картирование генома домашних животных стало важным подходом в генетических исследованиях. Карта генома собачьих маркеров охватывает хромосомный анализ и включает информацию о 3270 генетических маркерах. [3] Быстрый прогресс в этой области способствовал сравнительному анализу генома, включая эволюционные исследования некоторых видов, принадлежащих к семейству. Анализ генома млекопитающих, с использованием окраски хромосом позволил реконструировать предковый кариотип отряда Carnivora, который состоял из 42 хромосом, большинство из них сохранены в кариотипе кошек, но сильно перестроены у собак. [7, 17]

Дифференциация половых хромосом началась рано в ходе эволюции млекопитающих. [2] Кариотип почти всех плацентарных млекопитающих, живущих сегодня, включает пару гетерохромосом: XX у самок и XY у самцов. Геномы разных видов могут содержать гомологичные блоки синтении, указывающие на то, что они имеют общее происхождение. Один из инструментов, используемых для их идентификации, – метод Zoo-FISH. Цель исследования – определить, могут ли половые хромосомы некоторых членов семейства Canidae (домашняя собака, рыжая лисица, песец, межвидовой гибрид: песец × рыжая лисица и китайская енотовидная собака) быть эволюционно консервативными. Проведен сравнительный цитогенетический анализ Zoo-FISH с использованием окрашивающих зондов, специфичных для гетеросом домашних собак. Результаты показывают наличие гомологичной синтении, охватывающей всю структуру X- и Y-хромосом. Это говорит о том, что половые хромосомы консервативны в семействе Canidae. Данные, полученные с помощью анализа кариотипа Zoo-FISH, дополняют информацию от других методов сравнительной геномики, давая более полную картину эволюции генома.

Китайская енотовидная собака (2n = 54 + 2-3 B) и японская (2n = 38 + 3-4 B) – два подвида одного вида. Сравнительная хромосомная карта всего генома японской енотовидной и домашней собак (Canis familiaris) была составлена с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Зонды, специфичные для 38 аутосом, выявили 41 консервативный хромосомный сегмент у китайской енотовидной собаки. Каждый из зондов, взятых из хромосом 1, 13 и 19 собаки, окрашивал два сегмента хромосом китайской енотовидной собаки. [8]

Зонд с Х-хромосомой собаки выявил всю Х-хромосому китайской енотовидной собаки, зонд с Y-хромосомой собаки гибридизовался с псевдоавтосомной областью на (the Xpter) ПТР, а также со всей Y-хромосомой китайской енотовидной собаки. Сравнительный анализ закономерностей распределения консервативных сегментов, определенных по окраске собак, в геномах китайской и японской енотовидных собак показывает, что различия в кариотипах этих двух подвидов могли быть вызваны восемью робертсоновскими транслокациями. Большая разница в количестве хромосом между китайской и японской енотовидными собаками позволяет предположить, что их следует рассматривать как два разных вида.

Было проведено цитогенетическое исследование енотовидных собак на 10 самцах, выращенных на ферме. [10] B-хромосомы наблюдали на пахитенной стадии профазы I мейоза, на диакинезе и метафазе I мейоза, а также в соматических клетках для установления их количества, морфологии и паттернов передачи. Препараты митотических хромосом получены после окрашивания лимфоцитов крови методами GTG и CBG-манипуляции. В клетках обследованных животных было обнаружено переменное количество В-хромосом (1…3). С помощью метода CBG установлено, что конститутивный гетерохроматин равномерно распределен по всей длине плеч В-хромосомы. Методом GTG были идентифицированы три морфологических типа В-хромосом. В-хромосомы в первичных сперматоцитах образуют различные конфигурации спаривания (одно-, двух- и трехвалентные) и синаптонемные комплексы В-хромосом обычно располагаются вблизи XY полового бивалента. Это может привести к инактивации Х-хромосомы и последующим нарушениям в процессе сперматогенеза. Во время диакинеза и метафазы I мейоза наблюдали увеличение числа одновалентных В-хромосом, по сравнению со стадией пахитены профазы I мейоза, что может свидетельствовать об отсутствии хиазмы в парных хромосомах или преждевременной терминализации. [10] Дальнейшие исследования с использованием молекулярно-цитогенетических методов могут расширить наши знания о происхождении, эволюции и функции В-хромосом.

Исследования с иcпользованием молекулярных маркеров

Были представлены новые хромосомные соответствия космид клонов, полученных от собак и содержащих микросателлиты, геномам китайской енотовидной собаки и песца. [14] Локализации согласуются с данными, полученными в ходе экспериментов по сравнительному окрашиванию хромосом геномов этих животных. Однако парацентрические инверсии обнаружены путем сравнения порядка локусов в кариотипах собак. Количество физически картированных локусов увеличилось до тридцати пяти как у китайской енотовидной собаки, так и у песца.

Выполнена работа по установлению генетическими методами таксономической дистанции между енотовидной собакой (N. procyonoides) как объекта клеточного пушного звероводства, домашней собакой (Canis familiaris), обыкновенным волком (Canis lupus), обыкновенной лисицей (Vulpes vulpes) и песцом (Alopex lagopus или Vulpes lagopus). [1] На основе 20 ядерных нуклеотидных сиквенсов, 3 сиквенсов митохондриальной ДНК, кодирующих единицы I и II цитохром оксидазы С с фрагментами цитохром b, был проведен соответствующий анализ. Результаты выстроенного филогенетического древа показали генетическую близость енотовидной собаки к обыкновенной лисице и песцу и удаленность от домашней собаки. Размеры генетической дистанции между этими группами указывают на то, что енотовидная собака скорее относится к примитивным представителям семейства Canidаe.

Целью исследования Б. Сласка был анализ внутри- и межгруппового разнообразия у выращенных на фермах и диких енотовидных собак с использованием молекулярных маркеров. [11] Наблюдали генетические различия между отдельными группами енотовидных собак, сопровождавшиеся относительно высокой внутригрупповой генетической вариабельностью. У диких енотовидных собак самое высокое генетическое разнообразие, по сравнению с тремя исследуемыми группами енотовидных собак, выращенных на фермах, потому что они представляют собой отдельные филогенетические группы. Полученные результаты позволяют предположить, что разведение на фермах может привести к дифференциации в филогенетическую линию, отличную от линии диких енотовидных собак. В каждом случае генетическое расстояние между животными, выведенными на отдельных фермах, было ниже, чем расстояние между животными, выращенными на фермах, и дикими животными. Поскольку разведение на польских фермах полностью основано на ранжировании фенотипов, генотип местных животных по-прежнему связан с генотипом диких.

Исследованы короткие тандемные повторы у японской енотовидной собаки (STRS, или микросателлиты). [4] Свойства продуктов ПЦР изучены с помощью электрофореза и анализа последовательностей. Шесть аллелей были обнаружены электрофорезом у девяти японских енотовидных собак. Анализ последовательностей шести аллелей показал, что варианты основаны на разнице в общем количестве повторов GAAA и GCAA. Повторяющиеся элементы у японских енотовидных собак были проще, чем у собачьих аллелей. Шесть аллелей были обозначены как 12-16 и 18. Аллели 15 и 18 были разделены на 1512, 1514, 1515, 1813 и 1814 подаллелей в зависимости от времени повторения GAAA. Их частота: аллель 12=0,10, 13=0,17, 14=0,17, 1512=0,22, 1514=0,06, 1515=0,06, 16=0,06, 1813=0,06 и 1814=0,10. Гетерозиготность рассчитана как равная 0,79 по аллелям STR и 0,86 по субаллелям. Новые праймеры для японских енотовидных собак разработаны на основе последовательности аллелей японской енотовидной собаки. Этот набор праймеров успешно амплифицирован в виде ампликона небольшого размера, который больше подходит для практического применения, чем праймеры для собак. Локус ZUBECA4 оказался полезным STR для идентификации видов, индивидуумов, изучения родословной и популяции японских енотовидных собак.

Изучены возможные различия между фермерскими и живущими в дикой природе енотовидными собаками. [5] Анализ полиморфизма 15 микросателлитных последовательностей привел к выводу, что енотовидные собаки, выращенные на польских фермах, и дикие – две генетически различные группы. Дикие польские енотовидные собаки генетически больше похожи на популяцию диких животных Калининградской области, чем на сельскохозяйственных. Анализ микросателлитных локусов показал четкие генетические различия между выращиваемыми и живущими в дикой природе популяциями енотовидной собаки, несмотря на всего лишь 50-летнюю изоляцию двух групп животных. Популяция, выращиваемая на фермах, характеризовалась более высокой генетической изменчивостью, чем обитающая в дикой природе. На основе проведенных анализов предложены три микросателлитных локуса (inu014, ren13J22 и ren41d20) для определения происхождения животных, сбежавших с ферм.

Енотовидные собаки (Nyctereutes procyonoides) – инвазивные виды природы Восточной Азии с несколькими отличительными характеристиками. [6] В этой статье авторы сообщают о хромосомном геноме китайской собаки с высокой непрерывностью, полнотой и точностью.

Сохраненные гены вкусовых рецепторов, расширенные семейства генов и положительно отобранные, связанные с пищеварением, абсорбцией, поиском пищи и детоксикацией, вероятно, подтверждают всеядность енотовидных собак. Несколько положительно отобранных генов и специфичные для енотовидных собак мутации в генах TDRD6 и ZP3 могут объяснить их высокую репродуктивность. Было высказано предположение, что повышенные показатели энергетического обмена и положительно отобранные иммунные гены тесно связаны с разнообразной иммунной системой енотовидных собак. Мы обнаружили, что несколько расширенных семейств генов и положительно отобранные гены, связанные с липидным обменом и инсулинорезистентностью, могут способствовать зимнему сну енотовидной собаки. Этот высококачественный геном представляет собой ценный ресурс для понимания эволюционных особенностей вида.

Провели успешное исследование геномных карт разных псовых, включая виды, рассматриваемые как сельскохозяйственные животные. [9] Собачьи зонды BAC (бактериальная искусственная хромосома), содержащие три гена, участвующих в определении пола (SOX9 – область Y- box 9, определяющая пол, AMH – антимюллеровский гормон и AR – рецептор андрогена), были картированы в хромосомах собаки, рыжей лисы, песца и китайской енотовидной собаки. Локализация этих генов может быть полезна в ассоциативных исследованиях, посвященных моногенетическим интерсексуальным расстройствам.

Выводы. В результате исследований установлено, что в природе существует три подвида енотовидной собаки: N. p. procyonoides (Китай), N. p. Ussuriensis (Россия) и N. p. viverrinus (Японские острова). Животные этих подвидов мало отличимы фенотипически, но имеют различное гаплоидное число хромосом: N. p. ussuriensis (54 хромосомы + 2 В-хромосомы), N. p. procyonoides (2n = 54-58 + 2-3 B-хромосомы) и N. p. viverrinus (2n = 38 + 3-4 B-хромосомы). Установленные различия в кариотипах последних двух подвидов могли быть вызваны восемью робертсоновскими транслокациями.

Енотовидная собака – не только объект промысловой охоты, с 1928 года ее также разводят на фермах в России. В работе были использованы енотовидные собаки, содержавшиеся в клеточных условиях и принадлежавшие к подвиду Nyctereutes procyonoides ussurensis. Описаны кардиологическое исследование митотических хромосом и электронно-микроскопический (ЭМ) анализ синаптонемных комплексов (СК) сперматоцитов на стадии средней пахитены, а также СК-кариотипирование на основе этого анализа. СК-кариотип состоит из 5 СК аутосомных метацентриков, 21 СК аутосомных акроцентриков и ХУ-половых хромосом (Х-хромосома – метацентрик среднего размера, У-хромосома – наименьший акроцентрик). Разные кариологические показатели необходимы для выявления нарушений в митозе и мейозе, обусловленных хромосомными аберрациями.

Проведен обзор молекулярных исследований для выявления генетических различий между подвидами.

×

Sobre autores

Larisa Safronova

Severtsov Institute of Ecology and Evolution of the RAS

Autor responsável pela correspondência
Email: ldsafronova@gmail.com

Grand PhD in Biological Sciences

Rússia, Moscow

Vera Sycheva

Severtsov Institute of Ecology and Evolution of the RAS

Email: ldsafronova@gmail.com

PhD in Biological Sciences

Rússia, Moscow

Evgeniy Sergeev

V.A. Afanasyev Scientific Research Institute of Fur Farming and Rabbit Breeding of the Russian Academy of Sciences

Email: ldsafronova@gmail.com

PhD in Agricultural Sciences

Rússia, Village Rodniki, Ramenskoye district, Moscow region

Bibliografia

  1. Lapa P., Lapinski S., Slivyak V., Barabash B. Ocenka geneticheskoj distancii mezhdu enotovidnoj sobakoj (Nyctereutes procionoides) i drugimi predstavitelyami semejstva Canidae // Vestnik VOGiS. 2009. T. 13. № 3. S. 647–654.
  2. Bugno-Poniewierska M., Sojecka A., Pawlina K. et al. Comparative cytogenetic analysis of sex chromosomes in several Canidae species using Zoo-FISH // Foliabiologica (Kraków). 2012. Vol. 60. PP. 11–16.
  3. Guyon R., Lorentzen T.D., Hitte C. et al. A 1-Mb resolution radiation hybrid map of the canimne genome. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2003. № 100. РР. 5296–5301.
  4. Hayashizono N., Ago K., Hayashi T. et al. Amplification of Microsatellites of Japanese Raccoon Dogs (Nyctereutes procyonoides viverrinus) with Primers for the Dog ZUBECA4 Locus // Med. J. Kagoshima Univ. 2010. Vol. 61. No. 3. РР. 41–46.
  5. Kasperek K., Horecka B., Jakubczak A. et al. Analysis of genetic variability in farmed and wild populations of raccoon dog (Nyctereutes procyonoides) using microsatellite sequences// Annals of Animal Science. 2015. Vol. 15. No. 4. PP. 889–901. https://doi.org/10.1515/aoas-2015-0048
  6. Lan T., Li H., Yang S. et al. The chromosome-scale genome of the raccoon dog: Insights into its evolutionary characteristics. // 3, 10. I Science 25, 105117 October 21, 2023, 10, https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105117*
  7. Murphy J., Stanyon R. and O’brien S.J. Evolution of mammalian genome organization inferred from comparative gene mapping // Genome Biology. 2001. № 2. РР. 1–8.
  8. Nie W., Wang J., Perelman P. et al.Comparative chromosome painting de¢nes the karyotypic relationships among the domestic dog, Chinese raccoon dog and Japanese raccoon dog // Chromosome Research. 2003. № 11. РР. 735–740.
  9. Nowacka-Woszuk J. and Switonslki M. Comparative cytogenetic mapping of three genes involved in sex determination in four species of the family Canidae // Journal of Animal and Feed Sciences. 2010. № 19. PР. 5–12.
  10. Onderka A., Bugno M., Szeleszczuk O., Slota E. Cytogenetic investigation of racoon dogs (Nyctereutes procyonoides) // Annals of animal science. 2008. Vol. 8. № 3. РР. 271–280.
  11. Slaska B., Zieba G., Rozempolska-Rucinska I. et al. Evaluation of Genetic Biodiversity in Farm-bred and Wild Raccoon Dogs in Poland // Folia biologica (Kraków). 2010. Vol. 58. № 3-4. РР. 195–199. https://doi.org/10.3409/fb58_3-4.195-199
  12. Sosnowski J., Migalska L., Lukaszewicz A. et al. MLH1 foci as an evidence of recombination events between B chromosomes in Chinese raccoon dog (Nyctereutes procyonoides procyonoides) and red fox (Vulpes vulpes) // Genetics. 18th international colloquium of animal cytogenetics and gene mapping. June 08–10. 2008. Bucharest.
  13. Świtoński M., Rogalska-Niznik N., SzczerbalI., Bear M. (Chromosome polymorphism and karyotype evolution of four canids: the dog, red fox, arctic fox and raccoon dog (review) // Caryologia, 2003. № 56. РР. 375–385.
  14. Szczerbal I., Rogalskay-Nijniy H., Shelling C. et al. Develoрment cytogenetic map genomes of the Chinese raccoon dog (Nyctereutes procyonoides procyonoides) and Alopex lagopus using microsatellitovs // Cytogenet Genome Res. 2003. № 102(1-4). РР. 267–71. https://doi.org/ 10.1159/000075761/
  15. Trifonov V.A., Perelman P.L., Kawada S.I. et al. Complex structure of B-chromosomes in two mammalian species: Apodemus peninsulae (Rodentia) and Nyctereutes procyonoides (Carnivora) // Chromosome Research 10. 2002. № 109. РР. 109–116.
  16. Wayne R. and Vila C. Phylogeny and Origin of the domestic dog // In: The genetics of the dog, 1st ed (edited by Ruvinsky A. and Sampson J). CABI Publishing. 2001. РР. 1–13.
  17. Yang F., Milne B.S., Schelling C. et al. Chromosome identification and assignment of dog DNA clones in the dog using a red fox and dog comparative map // Chromosome Research. 2000. № 8. РР. 93–100.

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2025

Creative Commons License
Este artigo é disponível sob a Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional.