Laboratory of bioassays and mechanism of action of bioactive substances: recent advances in bioactive compound

Full Text

Введение

Основной круг научных интересов и научное направление лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ ТИБОХ ДВО РАН – изучение биологической активности природных и синтетических соединений; фиторегулирующей активности на моделях проростков сельскохозяйственных растений; проведение скрининга среди соединений для обнаружения цитотоксической, гемолитической, эмбриотоксической, антибактериальной, антифунгальной и противоопухолевой активностей на моделях культур клеток микроорганизмов, животных и человека; поиск соединений с гепатозащитными и иммуномодулирующими свойствами; исследование препаратов, обладающих протекторными свойствами, на экспериментальных животных моделях ишемии и инфаркта миокарда, инсульта головного мозга, артериальной гипертензии, воспаления и цирроза, нейродегенеративных заболеваний; установление зависимости между структурой вещества и его биологической активностью; компьютерное моделирование пространственной структуры биологических молекул; моделирование взаимодействия биологически активных соединений с внутриклеточными и мембранными молекулярными мишенями. Объектами исследования являются биологически активные вещества, выделенные из наземных растений, морских микроорганизмов, водорослей и беспозвоночных и их синтетические аналоги.

В обзоре кратко рассматриваются основные достижения лаборатории за последние пять лет.

Накопления рутина в гречихе обыкновенной

Гречиха является ценной сельскохозяйственной культурой, возделываемой во многих странах мира. Большой интерес гречиха представляет как источник биофлавоноидов. Известно, что флавоноиды принимают активное участие в физиологических процессах растительной клетки и могут оказывать влияние на репродуктивные процессы, способствовать ризогенезу, подавлять развитие патогенов, регулировать процессы окислительного фосфорилирования, являются универсальными полифункциональными адаптогенами к неблагоприятным факторам среды. Флавоноиды гречневой крупы предупреждают развитие злокачественных новообразований, предохраняют организм от старения и болезней, стимулируют иммунитет. Одним из перспективных источников является выращиваемая в Дальневосточном регионе гречиха Fagopyrum esculentum Moench. В селекции гречихи актуальное и приоритетное направление – выведение сортов с высоким содержанием флавоноидов (рутина) в зерне и надземной части растений. Получение клеточных культур из различных частей растения с использованием высоких доз ионов тяжелых металлов, манипуляции с ними могут служить базисом для последующего отбора вариантов с качественно новыми показателями. В то же время для получения форм растений с повышенным уровнем стрессоустойчивости, увеличения урожайности, улучшения качества зерна эффективным подходом является использование биопрепаратов, таких как биостимуляторы, биологические средства защиты растений, биоудобрения и ряд других. Практическая значимость этих исследований также в том, что помимо зерна, идущего в пищу, надземная часть этого растения может служить источником получения рутина для фармацевтической промышленности.

Совместно с сотрудниками ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки (академик РАН Клыков А.Г.) мы проводим исследование содержания рутина и продуктивности сортов гречихи различного эколого-географического происхождения и селекционного материала, полученного в условиях in vitro на селективной среде с повышенным содержанием тяжелых металлов. Изучено содержание рутина в плодах и надземной массе у отечественных и зарубежных сортов гречихи, а также в разных генотипах этой культуры. Выделен сорт гречихи Башкирская красностебельная с максимальным содержанием флавоноидов в плодах и надземной массе [1, 2]. Установлено, что содержание рутина в надземной части гречихи зависит от рода, вида и разновидности растения, а также определяется морфологическими и хозяйственно ценными признаками. Использование селективных сред с высокими концентрациями ионов цинка и меди способствует расширению диапазона генетической изменчивости и получению растений-регенерантов с повышенным содержанием рутина (на 20–25 %) [3, 4]. Повышенная продукция рутина наблюдалась в регенерированных в пробирке растениях гибрида гречихи Изумруд × Инзерская, полученных после воздействия высоких доз цинка [5] (рис. 1). Исследовано влияние биологически-активных веществ на содержание рутина в плодах и надземной массе гречихи сорта Изумруд. Установлено, что при применении экстрактов из биотипа красных стеблей гречихи наблюдается повышение технологических и биохимических показателей качеств зерна гречихи [6].

 

Рис. 1. Содержание рутина в регенерированных в пробирках растениях F. esculentum сорта Изумруд и гибрида Изумруд × Инзерская, полученных после воздействия питательных сред с цинком и выращенных in vitro в течение III–V пассажей. На врезке – химическая структура рутина

 

Таким образом, генотипы гречихи, полученные в том числе с использованием культуральных сред с высокими концентрациями тяжелых металлов, являются перспективными биосистемами для синтеза рутина, ценного в фармакологии и медицине.

Нейропротекторные эффекты гистохрома на фоне экспериментальной артериальной гипертензии

В лаборатории разработан метод с применением диффузионно-взвешенной томографии для выявления бессимптомного поражения головного мозга. Изучено потенциальное нейропротекторное лекарственное средство гистохром, предотвращающее диффузионные изменения ткани головного мозга крыс на ранней стадии развития АГ (артериальной гипертензии). Несмотря на достижения современной медицины, распространенность АГ среди населения чрезвычайно высока, в том числе среди лиц молодого возраста. Начальные проявления АГ начинаются бессимптомно и могут развиваться длительное время. Очень важно распознать начало развития заболевания для оказания своевременной терапии. Маркерами для раннего выявления АГ являются мелкие гиперинтенсивные очаги в глубинных отделах мозга, так называемые немые инфаркты, которые выявляются только методом МРТ (магнитно-резонансная томография). Со временем такие скрытые инфаркты приводят к когнитивным нарушениям, деменции, инсультам [7]. Диффузионно-взвешенная томография позволяет выявить изменения ткани головного мозга (ГМ) на ранней стадии развития патологии, определить направление диффузии молекул воды. Особенный интерес в диагностике заболеваний ГМ относится к методу спиновой маркировки артериальной крови, позволяющей отследить в кратчайшее время цереброваскулярные изменения на молекулярном уровне. Представленный метод дает возможность получить изображения почти всех биологических тканей, взвешенных по диффузии молекул воды in vivo [8].

Своевременная диагностика ранних проявлений патологии позволяет предотвратить более глубокие последствия развития АГ. При использовании возможностей МРТ гиперинтенсивные очаги белого вещества ГМ у пациентов с предположением на АГ выявляются более чем в 85 % случаев. В связи с тем что контингент больных разнороден по возрасту и наличию осложнений сопутствующих заболеваний, соответственно, развитие патологии также разнородно. Для полноценного ответа на различные проявления АГ совершенствуются дополнительные методы диагностики и экспериментальные модели на животных. Используемая экспериментальная модель дает возможность исследовать механизм развития заболевания, а импульсная последовательность позволяет визуализировать скорость движения молекул воды (рис. 2, а, б) [9].

 

Рис. 2. Визуальная оценка интенсивности сигнала на диффузионном изображении аксиального среза головного мозга крысы, полученного методом МРТ; на участках, выделенных желто-красным цветом, скорость диффузии выше, по сравнению с участками, представленными синим цветом (а). Количественное определение скорости диффузии воды, выполненное с помощью измерения коэффициента диффузии; снижение диффузии отмечено на графике розовой линией, указанной стрелкой (б)

 

Множество антигипертензивных препаратов уже успешно используется в клинической практике, однако поиск новых средств остается актуальной задачей и активно продолжается в настоящее время. В серии наших экспериментов антиоксидант и хелатор молекулярного железа гистохром использован по прямому назначению на самой ранней стадии агрегации эритроцитов и тромбоцитов в микрокапиллярном русле [10]. Гистохром, вероятно, обладает нейропротективными свойствами благодаря своей способности прерывать каскад патологических реакций. Нейропротекторы известны как вещества, которые повышают устойчивость мозговой ткани к вредным воздействиям различной природы. Использование гистохрома перспективно как в комплексе с лекарствами прямого назначения, так и в качестве препарата превентивного действия. Потенциальный нейропротекторный эффект гистохрома на данной модели допускает защиту медиаторного и метаболического баланса, способность качественно влиять на состояние кровотока.

Индукция АГ осуществлялась согласно допустимым протоколам работы с лабораторными крысами. В исследовании использовали фармакопейный препарат «Гистохром®» в форме 0,02 % раствора для внутривенного введения (ТИБОХ ДВО РАН, Россия). Поведенческий статус животных оценивали в тесте «Открытое поле». Основную оценку ГМ проводили в режиме диффузионно-взвешенной импульсной последовательности с помощью магнитно-резонансного томографа «PharmaScan US 70/16», 7.0 Т, 300 MHz (Bruker). Индуцированную АГ у крыс верифицировали как усиление сигнальных характеристик ткани ГМ в сравнении с интактными животными. Гиперинтенсивный сигнал от ткани говорит об избыточном скоплении жидкости в интра- и экстрацеллюлярном пространстве, что ассоциируется с гиперволемией. После курсового введения гистохрома отмечено снижение нарушенной церебральной микроциркуляции. Поведенческий статус животных характеризовался сокращением латентного периода выхода крыс в центр поля на 20 %, увеличением когнитивной активности в 1,6 раза и возрастанием исследовательского компонента поведения до 30 % [11]. На рис. 2 представлен фрагмент аксиального среза головного мозга крысы на фоне формирования АГ. На графике зафиксировано снижение скорости диффузии воды в подкорковой зоне ГМ (на рис. 2, А он отмечен линиями, пересекающимися под углом 90°).

Представленные результаты предполагают возможность использования антиоксидантных свойств препарата гистохром как превентивного средства в лечении АГ.

Противомикробная активность метаболитов морских грибов

Последние пять лет в лаборатории проводился масштабный поиск ингибиторов различных бактериальных ферментов, которые рассматриваются как альтернатива мишеням «классических» антибиотиков. Одной из мишеней для этого поиска был выбран фермент сортаза А, контролирующий образование биопленок грамположительными бактериями Staphylococcus aureus (рис. 3). Ингибиторы сортазы А были обнаружены среди вторичных метаболитов морских грибов Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН. Это цереброзид флавузид B [12], ряд антрахинонов [13], циклопиановые дитерпены [14], хлорсодержащие пренилированные тетракетиды [15], трипептидные производные астеррипептиды А-С [16]. Более того, было установлено, что некоторые из этих соединений эффективно противодействуют повреждению клеток кожи при стафилококковой инфекции. Так, флавузид В снижал выход лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уменьшал уровень апоптоза в инфицированных кератиноцитах человека линии HaCaT [12], а антрахиноны акруцихонон А и ω-гидроксипахибазин не только обеспечивали снижение выхода ЛДГ из инфицированных кератиноцитов, но и способствовали ускорению их миграции в in vitro модели инфицированной кожной раны [13].

 

Рис. 3. Схема действия антибиотиков, мишенью которых является сортаза А. Фермент сортаза А – один из ключевых при образовании биопленок грамположительными бактериями Staphylococcus aureus (1), что при инфицировании клеток кожи приводит к торможению их пролиферации (2) и миграции (3). Ингибирование активности сортазы А (4) обеспечивает восстановление уровня пролиферации кератиноцитов (5) и их миграции (6)

 

Другой мишенью для поиска новых антибиотиков является уреаза – фермент, обеспечивающий метаболизм мочевины. Было обнаружено, что известный антимикотик гризеофульвин, продуцируемый морскими грибами, способен ингибировать активность уреазы и значительно увеличивать жизнеспособность кардиомиоцитов, инфицированных S. aureus, в in vitro модели инфекционного миокардита [17]. Эти исследования, проводимые совместно с сотрудниками лаборатории химии микробных метаболитов (рук. к.х.н. Юрченко А.Н.) и лаборатории микробиологии (рук. чл.-корр. РАН, д.б.н. Михайлов В.В.) ТИБОХ ДВО РАН за довольно короткое время привели к обнаружению более чем 10 новых перспективных антибиотиков.

Поиск соединений с кардиопротекторным действием

Поиск соединений с кардиопротекторным действием среди вторичных метаболитов морских грибов и беспозвоночных животных проводился с использованием культивируемой клеточной линии кардиомиоцитов крысы Н9с2, что позволило оценить активность большого количества соединений. Было показано, что глиорозеин повышает жизнеспособность кардиомиоцитов крысы в модели хронической гипоксии и при действии токсина ротенона [18]. Феликарнезолин В также повышал жизнеспособность кардиомиоцитов в модели гипоксии, что сопровождалось снижением уровня активных форм кислорода и увеличением активности антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы [19]. Рабдастреллозид B также повышал жизнеспособность кардиомиоцитов в модели гипоксии, вызванной хлоридом кобальта (II) [20], а топорозиды А, С и D – при воспалении, вызванном культивированием кардиомиоцитов в присутствии воспалительного цитокина TNF-α [21].

Поиск соединений, обладающих нейропротекторной активностью

Нами был проведен целенаправленный поиск нейропротекторов среди низкомолекулярных метаболитов некоторых морских беспозвоночных и микроорганизмов. В результате скрининга обнаружен ланостановый тритерпеноид ацетилпенастерон, выделенный из морской губки Penares sp. Это соединение обладает выраженными цитопротекторными свойствами: эффективно увеличивает жизнеспособность клеток в модели болезни Паркинсона, индуцированной в нейрональных клетках нейротоксином паракватом (PQ), существенно снижает уровень активных форм кислорода (АФК) и устраняет митохондриальную дисфункцию, а также индуцирует синтез шаперона (белка теплового шока) Hsp70 в клетках, что приводит к восстановлению жизнеспособности нейронов и увеличению числа нейритов, формирующих нейрональную сеть [22].

Изучалось цитопротекторное действие нескольких поликетидов из морского гриба Aspergillus сandidus KMM 4676 и цереброзида флавузида B из морского гриба Penicillium islandicum в отношении клеток Neuro-2a в присутствии нейротоксинов ротенона и PQ. Было показано, что исследованные соединения значительно увеличивают жизнеспособность клеток, обработанных нейротоксинами, и снижают уровни токсичных АФК в них, что указывает на перспективность дальнейшего исследования данных метаболитов в качестве нейропротекторов [23].

Данные молекулярного докинга показали, что ряд поликетидов и алкалоидов с цитопротекторными свойствами из морских грибов: глиорозеин, нивеоглауцин А, 6-гидрокси-N-ацетил-β-оксотриптамин, 4-гидроксициталон и 4-гидрокси-6-дегидроксициталон могут образовывать водородные связи с аминокислотными остатками Arg415 или Arg483 в P1-P2 карманах в сайте связывания Nrf2 и домена Kelch белка Keap1. Эти положения малых молекул в домене Kelch способны ингибировать взаимодействие Keap1 с Nrf2 и усиливать ядерную транслокацию Nrf2 из цитозоля, что может приводить к сверхэкспрессии родственных генов, обеспечивающих антиоксидантный ответ [24].

Природные и синтетические 1,4-нафтохиноны (1,4-NQs) характеризуются широким спектром биологической активности. За последнее десятилетие у этих соединений обнаружены кардиопротекторные, противоишемические, гепатопротекторные, нейропротекторные свойства, установлена их роль в защите от нейродегенеративных заболеваний, более детально изучена их противовоспалительная, противомикробная и противоопухолевая активность, открыты новые, ранее неизвестные внутриклеточные молекулярные мишени и механизмы действия. Некоторые соединения этого класса уже используются в качестве лекарственных препаратов, а некоторые вещества могут быть использованы как биохимические инструменты и зонды для неинвазивного обнаружения патологических участков в клетках и тканях при инфаркте миокарда и нейродегенеративных заболеваниях с применением современных методов молекулярной визуализации [25].

В лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ ДВО РАН (рук. д.х.н. Ануфриев В.Ф.) была создана мини-библиотека из порядка 150 синтетических производных 1,4-NQs. На начальном этапе нами изучена цитотоксическая и гемолитическая активность новых тетрациклических конъюгатов на основе производных биологически активных хинонов: 5,8-диметокси-1,4-нафтохинона, 5-гидрокси-1,4-нафтохинона и серии пер-О-ацетил-1-меркаптомоносахаридов. Установлено, что тетрациклические производные на основе 5,8-диметокси-1,4-нафтохинона не активны. Самую высокую цитотоксичность в отношении нейрональных клеток Neuro-2a проявили линейные тетрациклические производные юглона. Шесть тетрациклических конъюгатов, несущих гидроксильную группу в нафтохиноновом ядре, показали высокую цитотоксическую активность со значениями EC₅₀ (эффективная концентрация вещества, подавляющая жизнеспособность 50 % клеток) в диапазоне от 0,3 до 1,2 мкМ и отсутствие гемолитической активности до 25 мкМ [26].

Были проведены исследования цитотоксической и гемолитической активности 40 новых синтетических тиогликозидных производных 1,4-нафтохинона в отношении различных линий опухолевых клеток человека. Использовалась панель клеток, включающая нейробластому SH-SY5Y, аденокарциному толстого кишечника HCT-116, лейкемию THP-1 и аденокарциному шейки матки HeLa. Для сравнения использовали неопухолевую клеточную линию почек эмбриона человека HEK-293. В результате было отобрано 10 соединений, которые в микромолярном диапазоне концентраций подавляли рост определенных опухолевых линий. Среди них соединения с лабораторными кодами U-732 и U-733 проявили сопоставимую цитотоксическую активность в отношении всех исследуемых клеточных линий со значением полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС₅₀) в диапазоне 2,95–5,09 мкМ. Наиболее эффективным оказалось соединение U-704 в отношении клеток HeLa c ЕС₅₀ = 2,25 мкМ и HCT-116 с ЕС₅₀ = 3,49 мкМ. Производное U-703 селективно подавляло рост клеток лейкемии человека ТНР-1 с ЕС₅₀ = 4,68 мкМ, в то время как U-733 наиболее эффективно ингибировал жизнедеятельность клеток нейробластомы человека SH-SY5Y с ЕС₅₀ = 3,71 мкМ. В результате скрининга гемолитической активности, проводимого на эритроцитах из крови доноров, установлено, что фактически все исследуемые тиогликозидные производные 1,4-NQs неактивны в диапазоне концентраций до 100 мкМ. Исключением является лишь одно соединение U-700, для которого полумаксимальная эффективная концентрация гемолиза составила 4,64 мкМ, а цитотоксическая активность для всех типов клеток была >10 мкМ.

Для 1,4-NQs, проявляющих цитотоксическую активность, осуществлено построение QSAR (Quantitative Structure – Activity Relationship) моделей связи химическая структура – цитотоксическая активность и проведен фармакофорный анализ. Проанализировано порядка 400 дескрипторов, описывающих физико-химические свойства химических соединений и отобрано 12 значимых дескрипторов. Установлено, что повышение цитотоксической активности значительно коррелирует с увеличением общего размера молекул и площади поверхности гидрофобных атомов этих молекул.

Важную роль в проявлении токсичности играет углеводный компонент с гидрофобными функциональными группами (AcO-) как для –O–, так и для –S– гликозидов. Заместители у C-2 играют ключевую роль в проявлении цитотоксической активности производных нафтазарина. Производные с метоксигруппой при С-2 или несущие остаток ацетилированного моносахарида в положении C-3 обязательно проявляют цитотоксическую активность, в то же время все производные с гидроксигруппой при С-2 нетоксичны [27].

В результате высокопродуктивного скрининга мини-библиотеки 1,4-NQs отобран ряд соединений, эффективно защищающих нейрональные клетки Neuro-2a в моделях БП (болезнь Паркинсона) in vitro, индуцированной нейротоксинами паракватом (PQ) и 6-гидроксидофамином (6-OHDA). Соединения значительно защищают клетки от подавления активности фермента эстеразы, лизиса биомембран и нормализуют клеточный цикл в присутствии нейротоксинов. Защитные эффекты связаны с их выраженной способностью улавливать токсичные свободные радикалы, образующиеся под действием нейротоксинов, с подавлением окислительного стресса и нормализацией функции митохондрий. Проведенный количественный QSAR анализ связи структура–активность in silico показал, что гидрофобность, полярность, заряд, форма молекул и молекулярная масса имеют решающее значение в проявлении нейропротекторных свойств исследуемых соединений (рис. 4) [28].

 

Рис. 4. QSAR анализ связи химическая структура – нейропротекторная активность. Прогнозируемая нейропротекторная активность (в %) 1,4-NQs в зависимости от экспериментальных значений для линии клеток Neuro-2a в присутствии PQ (а) или 6-OHDA (б). Электростатическая карта, предсказывающая предпочтительные местоположения для гидрофобных участков (зеленый цвет), акцепторов водородных связей (синий цвет), доноров водородных связей (красный цвет) для неактивного U-193 (в) и высокоактивного нейропротектора U-623 (г)

 

Были выявлены два эффективных соединения, U-443 и U-573, с высоким потенциалом защиты нейрональных клеток Neuro-2a от токсического воздействия ротенона на модели нейротоксичности in vitro. Выбранные 1,4-NQs продемонстрировали способность снижать окислительный стресс за счет снижения уровней АФК и оксида азота (NO) в нейрональных клетках Neuro-2a и макрофагах RAW 264.7 и значительные антиоксидантные свойства в тесте железоиндуцированного окисления липидов в гомогенате головного мозга мыши. Показано, что в присутствии исследуемых 1,4-NQs нормализовалась функция митохондрий и восстанавливался митохондриальный мембранный потенциал, нарушенные воздействием нейротоксина. Кроме того, в низких концентрациях эти соединения значительно снижали уровни провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1β и заметно ингибировали активность циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) в макрофагах RAW 264.7. Результаты докинга продемонстрировали, что 1,4-NQs связываются с активным центром ЦОГ-2 аналогично селективному ингибитору этого фермента SC-558. Оба вещества значительно улучшили поведенческие реакции у самок мышей CD1 с индуцированной ротеноном ранней стадией БП in vivo (рис. 5). Предполагается, что 1,4-NQs U-443 и U-573 могут защищать нейроны и микроглию благодаря своей мощной антиоксидантной и противовоспалительной активности [29].

 

Рис. 5. Схема действия производных 1,4-NQs U-443 и U-573, защищающих нейрональные клетки Neuro-2a и макрофагальные клетки RAW 264.7 от нейротоксического действия ротенона, оказывающих противовоспалительный эффект и восстанавливающих когнитивное поведение у животных с индуцированной ранней стадией БП

 

Производные 1,4-нафтохинона, блокирующие пуринергические P2X7 рецепторы

Пуринергические Р2Х рецепторы экспрессируются в клетках и тканях многих видов животных, включая человека. Они играют важную роль в различных физиологических процессах и способны модулировать сердечный ритм, инициировать сокращение клеток скелетных мышц и различных тканей гладких мышц, а также модулировать иммунный ответ. Эти рецепторы участвуют во многих патологических состояниях и могут являться молекулярными мишенями действия лекарственных соединений. Терапевтический потенциал агонистов и антагонистов Р2Х рецепторов в настоящее время исследуется при ряде расстройств, в том числе при хронической невропатической и воспалительной боли, депрессии, кистозном фиброзе, сухости глаз, синдроме раздраженного кишечника, интерстициальном цистите, дисфункции мочевого пузыря, раке и ряде внутриклеточных инфекций. Однако эти исследования сдерживаются отсутствием эффективных и селективных модуляторов пуринорецепторов. Поэтому поиск новых соединений, способных активировать или блокировать Р2Х рецепторы, является чрезвычайно актуальной задачей [30].

Рецептор P2X7 типа представляет собой АТФ-управляемый ионный канал, а также потенциальную терапевтическую мишень для разработки новых лекарств. В лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Полоник С.Г. и к.х.н. Сабуцкий Ю.Е. синтезировали серию новых производных 1,4-NQs, было исследовано их антагонистическое действие против P2X7 рецепторов мыши. Нами изучалась способность тестируемых веществ блокировать АТФ-индуцированный приток Са²⁺ в нейрональные клетки Neuro-2a мыши, в результате чего выбраны четыре наиболее эффективных вещества: 1,4-нафтохинонтиоглюкозиды U-548 и U-557, а также их тетрациклические конъюгаты U-286 и U-556.

Биологическое тестирование этих соединений выявило значительное ингибирование функций рецептора in vitro. Анализ in silico показал высокую вероятность взаимодействия 1,4-NQs с P2X7 рецептором. Полученные данные указывают на потенциал связывания рассматриваемых соединений с аллостерическим сайтом, расположенным во внеклеточной области P2X7 рецептора. Добавление растворов соединений к клеткам приводило к заметной блокаде АТФ-индуцированного поглощения бромистого этидия (EtBr) и флуоресцентного красителя YO-PRO-1, а также выраженному снижению продукции АФК и NO и защите жизнеспособности нейрональных клеток от токсического действия высоких концентраций АТФ (рис. 6) [31].

 

Рис. 6. 1,4-NQs модулируют функционирование Р2Х7 рецепторов. (а) – схема синтеза 1,4-нафтохинонтиоглюкозидов. (б) – влияние предварительной инкубации с 1,4-NQs (0,1; 1,0 и 5,0 мкМ), BBG (бриллиантовый синий G, 10 мкМ) и PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфоновая кислота, 50 мкМ) на вход ионов Ca²⁺, вызванный АТФ (2 мМ) в клетках нейробластомы Neuro-2a мыши. (в) – влияние предварительной инкубации клеток с 1,4-NQs (0,1; 1,0 и 10,0 мкМ) на поглощение EtBr. (г) – молекулярное моделирование; гомологическая модель тримерной структуры P2X7 рецептора мыши (mP2X7R, UniProt ID Q9Z1M0) в закрытой форме с 1,4-NQs. (д) – изображение клеток нейробластомы Neuro-2a мыши

 

Было исследовано анальгезирующее и противовоспалительное действие 1,4-NQs U-286, U-548 и U-556. Благодаря использованию таких подходов, как спектрофлуориметрия, спектрофотометрия, вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ, была установлена способность данных соединений ингибировать воспаление, опосредованное P2X7 рецептором. Воспаление индуцировалось добавлением АТФ/ЛПС в макрофагальных клетках RAW 264.7 мыши. Установлено, что выбранные соединения способны ингибировать АТФ-индуцированный приток кальция и продукцию активных форм кислорода, а также проявляют выраженную антиоксидантную активность в гомогенате головного мозга мышей. Кроме того, соединения U-286 и U-548 снижали ЛПС-индуцированную активность фермента ЦОГ-2, высвобождение провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1β в макрофагальных клетках и значительно защищали макрофаги от токсического действия АТФ и ЛПС.

Соединение U-548 продемонстрировало существенный ингибирующий эффект в антиноцицептивных тестах, уменьшая количество корчей в тесте «Уксусные корчи» и латентное время облизывания задних лап мышей в тесте «Горячая пластина». Связывание нафтохинон-тиоглюкозидного конъюгата U-556 с внеклеточной частью P2X7 рецептора подтверждено методом поверхностного плазмонного резонанса, в результате которого были установлены кинетические характеристики образования данного комплекса. Соединения U-286, U-548 и U-556 оказались способны почти полностью уменьшить размер вызванного каррагинаном отека лапы через сутки и обладали мощной противовоспалительной активностью. Наблюдаемые эффекты в макрофагах также сопровождались способностью изученных 1,4-NQs ингибировать образование макропоры P2X7 рецептора, связанного с воспалением и ноцицептивной болью [32–34].

Полученные результаты позволяют предположить, что соединения U-286, U-548, U-556 и U-557 могут стать перспективными моделями для разработки и создания новых блокаторов P2X7 рецепторов и лекарственных средств, обладающих противовоспалительной, противоболевой и нейропротекторной активностью. На основе данных исследований планируется разработка эффективных препаратов против хронических воспалительных патологий, нейропатической боли и нейродегенеративных заболеваний.

Противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов голотурий

Цитотоксическая и противоопухолевая активности гликозидов голотурий (морских огурцов) в отношении различных типов клеток и клеточных линий, включая опухолевые клетки человека, изучаются на протяжении многих лет. Однако молекулярный механизм противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов до сих пор остается неясным. Мы продолжаем изучение тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 (CA₂-2), выделенного из дальневосточной съедобной промысловой голотурии кукумария японская (Cucumaria japonica). Установлено, что CA₂-2 влияет на жизнеспособность опухолевых клеток в микромолярных концентрациях, в то же время в субцитотоксическом диапазоне концентраций гликозид проявляет цитостатический эффект, блокируя клеточную пролиферацию и биосинтез ДНК в S-фазе. Он индуцирует апоптоз в опухолевых клетках каспазозависимым способом, минуя активацию р53-зависимого сегмента. Также мы установили, что CA₂-2 проявляет выраженный противоопухолевый эффект in vivo [35].

Дальнейшее исследование эффективности, токсичности и механизма действия CA₂-2 мы проводили с использованием модели метастатического кастрационно-устойчивого рака предстательной железы (CRPC) in vitro. CA₂-2 индуцировал остановку клеточного цикла в фазе G₂/M в клетках PC-3 рака предстательной железы человека и вызывал каспазазависимый апоптоз. Кроме того, гликозид ингибировал образование и рост колоний клеток CRPC при низких микромолярных концентрациях. Впервые был проведен протеомный анализ, выполненный с использованием двумерного гель-электрофореза с последующим масс-спектрометрическим анализом и биоинформационной оценкой, который выявил изменения в белках, участвующих в клеточных процессах, таких как метастатический потенциал, инвазия и апоптоз (рис. 7). Среди белков, экспрессия которых изменяется под воздействием СА₂-2, с помощью протеомного подхода идентифицированы кератин 81, CrkII, IL-1β и катепсин B. Эти эффекты были подтверждены на уровне белка с помощью вестерн-блоттинга. Полученные результаты демонстрируют выраженную противоопухолевую активность CA₂-2 в модели рака предстательной железы и дают представление о молекулярном механизме, лежащем в основе этого действия [36].

 

Рис. 7. Изображения двумерных гель-электрофорезов белков клеток линии PC-3 в контроле (а) и после инкубирования в течение 48 ч с СА₂-2 (б). Увеличенные изображения пятен на геле, соответствующие регулируемым белкам-мишеням, под действием СА₂-2; знаком «+» обозначены пятна, соответствующие белкам, экспрессия которых менялась под действием СА₂-2, знаком «—» – белки-мишени контрольных клеток (в). Диаграмма Венна влияния СА₂-2 на экспрессию белков в опухолевых клетках простаты человека линии PC-3. Цифры показывают количество обнаруженных белков; стрелками указаны направления регулирования экспрессии (г)

 

Устойчивость опухолевых клеток одновременно ко многим токсическим противоопухолевым препаратам, с помощью которых проводится химиотерапия онкологических заболеваний, не сходным по химической структуре и механизму действия, достаточно давно известный феномен, получивший название «множественная лекарственная устойчивость» (МЛУ). Наиболее часто встречающийся механизм МЛУ –активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки. Одним из основных белков этого типа является Р-гликопротеин. Используя технику молекулярных флуоресцентных зондов и спектрофлуориметрию, мы установили, что в нецитотоксичных концентрациях СА₂-2 из голотурии C. japonica и фрондозид А из C. ohotensis, а также их комплексы с холестерином блокируют активность мембранно-транспортного Р-гликопротеина в клетках асцитной формы карциномы Эрлиха (АКЭ) мыши. Поскольку блокирование активности Р-гликопротеина приводит к подавлению МЛУ, эти гликозиды и их комплексы с холестерином могут рассматриваться как потенциальные ингибиторы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток [37].

На следующем этапе исследований мы применили анализ выброса кальцеина и измерение поглощения и удерживания стандартного цитостатика – доксорубицина (DOX) в опухолевых клетках АКЭ, а также определение цитотоксического и противоопухолевого эффектов DOX в сочетанном варианте с СА₂-2. Так, обработка клеток АКЭ тритерпеновым гликозидом CA₂-2 блокировала отток кальцеина и DOX из раковых клеток и увеличивала накопление и цитотоксичность DOX в клетках АКЭ. Более того, предварительная обработка мышей с АКЭ гликозидом CA₂-2, затем трансплантация опухолевых клеток свежим животным и последующее лечение этих мышей DOX значительно увеличили среднюю продолжительность жизни мышей, несущих опухоль, и, следовательно, значимо увеличили противоопухолевый эффект DOX in vivo [38].

Недавно было изучено порядка 20 тритерпеновых гликозидов, выделенных из кукумарии С. djakonovi. Эти соединения были исследованы на токсичность в отношении ряда опухолевых клеток человека (MCF-7, T-47D, MDA-MB-231, HL-60), а также нормальных клеток молочной железы человека MCF-10A и почек эмбриона НЕК-293. Все гликозиды были протестированы на мембранолитическую активность в отношении эритроцитов человека. Наиболее агрессивная трижды отрицательная клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231 оказалась наиболее чувствительной к действию гликозидов по сравнению с другими раковыми клетками. Охотозид A₁-1 и кукумариозид A₀-1 значительно ингибировали миграцию, а также образование и рост колоний клеток MDA-MB-231. Дьяконовиозид E₁ продемонстрировал избирательное действие в отношении ER-позитивных линий клеток MCF-7 и трижды негативных линий клеток MDA-MB-231, в то время как токсический эффект в отношении нормальных клеток эпителия молочной железы (MCF-10A) отсутствовал. Кукумариозид А₂-5 ингибировал образование и рост колоний раковых клеток до 44 % и миграцию опухолевых клеток до 85 % от контроля [39, 40].

Иммуномодулирующая активность кукумариозида А₂-2

В своих ранних работах мы установили, что тритерпеновый гликозид СА₂-2 проявляет ярко выраженную иммуномодулирующую активность [41]. Показано, что в основе иммуномодулирующего действия исследуемого природного соединения лежит его способность взаимодействовать прежде всего с клеточными мембранами иммунокомпетентных клеток и изменять их физико-химические свойства. Впервые обнаружено, что СА₂-2 в наномолярных концентрациях обратимо увеличивает микровязкость биомембран, что сопровождается обратимым изменением мембранного потенциала, деполяризацией биомембран и резким обратимым увеличением концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме за счет его поступления из внеклеточного пространства. Впервые показано, что на мембранах макрофагов существуют как минимум два сайта связывания СА₂-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации. Впервые установлено, что одними из молекулярных мишеней действия СА₂-2 являются мембранные пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са²⁺-проводимость в мембранах макрофагов и активацию клеток. Показано, что СА₂-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов. Связываясь с ними, гликозид усиливает ответ клеток на АТФ и частично снимает эффект десенсибилизации рецепторов. Установлено, что в перитонеальной полости мыши присутствует популяция крупных зрелых F4/80+ макрофагов, характеризующихся наличием высокой плотности пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Именно крупные F4/80+/Р2Х+ перитонеальные макрофаги принимают участие в Са²⁺-ответе на аппликацию СА₂-2 [42]. Методами радиоспектроскопии, масс-спектрометрим и масс-спектрометрического имиджинга впервые изучены и определены фармакокинетические параметры поведения СА₂-2 в селезенке мыши при внутрибрюшинном введении. Обнаружено, что СА₂-2 локализуется главным образом в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, проникает в центральную часть органа, где располагается красная и белая пульпа. Показано, что введение СА₂-2 мышам приводит к выраженной активации макрофагов селезенки и увеличению образования маркеров активации iba-1, IL-1β, iNOs, АФК и NO с изменением фенотипа (поляризации) макрофагов на М1 фенотип. Получены масс-спектрометрические профили пептидов/белков с использованием масс-спектрометрического анализа различных участков срезов селезенки, изолированных с помощью метода лазерной микродиссекции. Установлено, что иммуностимуляция животных путем введения CA₂-2 приводит к выраженным изменениям интенсивности характеристических пиков пептидов/белков селезенки, прежде всего в красной пульпе, где локализуются макрофаги [43–45].

Клеточная иммунотерапия, основанная на активации и доставке иммунных клеток с противоопухолевыми свойствами непосредственно к опухоли в организме, является одним из новейших и наиболее быстро развивающихся подходов в лечении рака. Несмотря на интенсивные разработки адоптивной терапии Т-лимфоцитами и NK-клетками, их использование против солидных опухолей остается малоэффективным вследствие слабого проникновения в опухолевые ткани. В связи с этим макрофаги, покидающие кровоток и свободно проникающие в новообразования, являются наиболее подходящими клетками для таргетной противоопухолевой иммунотерапии солидных опухолей. Однако их применение тормозится отсутствием эффективных и безопасных модуляторов активности макрофагов [46].

Мы обнаружили, что СА₂-2 способен в наномолярных концентрациях активировать и поляризовать макрофаги мыши в M1 фенотип ex vivo. Это приводит к выраженному усилению противоопухолевой активности макрофагов в отношении нескольких типов опухолевых клеток мыши in vitro. Макрофаги М1 уверенно распознают и быстро проникают в ткани опухоли в отличие от неактивированных макрофагов in vivo. Это, в свою очередь, приводит к заметному увеличению количества М1 макрофагов в опухолевых тканях, к существенному подавлению роста опухолей, включая трижды негативный рак молочной железы, и значимому увеличению средней продолжительности жизни животных-опухоленосителей (рис. 8).

 

Рис. 8. Стратегия клеточной противораковой иммунотерапии. Мышиные макрофаги активировали тритерпеновым гликозидом CA₂-2 и поляризовали в противоопухолевый M1 фенотип ex vivo. Затем макрофаги нагружали наночастицами, конъюгированными с флуоресцентным зондом ближнего инфракрасного диапазона CyTE777. Активированные и поляризованные флуоресцентные М1 макрофаги вводили мышам с опухолью для визуализации и локализации макрофагов, а также для проведения противоопухолевой клеточной иммунотерапии

 

Работа была проведена совместно с сотрудниками Национального университета Ян Мин Цзяодун, Тайвань (National Yang Ming Chiao Tung University, Taiwan). Использование природного иммуномодулятора СА₂-2 может стать очень перспективным подходом для разработки стратегии противоопухолевой клеточной иммунотерапии. Наше исследование показывает, что клеточная терапия на основе макрофагов может быть мощным терапевтическим вариантом против солидных типов опухолей [47].

Заключение

Таким образом, наши исследования природных и синтетических соединений за последние 5 лет привели к открытию целого ряда новых свойств биологических молекул и установлению отдельных элементов в молекулярных механизмах их действия. Показано, что определенные генотипы гречихи, культивируемые с использованием высоких концентраций цинка и меди, являются перспективными биосистемами для синтеза флавоноида рутина, ценного в фармакологии и медицине. Методом магнитно-резонансной томографии головного мозга крыс показана эффективность применения препарата гистохром в качестве превентивного средства в лечении артериальной гипертензии. Благодаря проводимому в лаборатории масштабному поиску новых противомикробных средств среди вторичных метаболитов морских грибов обнаружен ряд низкомолекулярных соединений, селективно ингибирующих бактериальные ферменты сортазу А и уреазу. Это приводит к выраженному подавлению данными соединениями стафилококковой инфекции в моделях инфицированной кожной раны и проявлению кардиопротекторных свойств в условиях гипоксии и инфекционного заражения кардиомиоцитов. Был проведен многопараметрический скрининг биологической активности среди синтетических производных 1,4-нафтохинона. Обнаружено, что определенные нафтохиноны обладают нейропротекторной и противовоспалительной активностью и способны эффективно защищать нейрональные и макрофагальные клетки от различных повреждений, вызванных нейротоксинами и индукторами воспаления. Для нескольких соединений установлен выраженный нейропротекторный эффект в модели болезни Паркинсона in vivo. Среди производных 1,4-нафтохинона найдены эффективные блокаторы пуринергических рецепторов Р2Х7 типа, ингибирование которых приводит к существенному подавлению ноцицептивной боли и нейровоспаления. Использование протеомного анализа позволило впервые установить детали молекулярного механизма противоопухолевого действия тритерпенового гликозида СА₂-2. Обнаружены ключевые внутриклеточные белковые мишени, экспрессия которых меняется под действием этого соединения в клетках рака предстательной железы человека, что сопряжено с проявлением противоопухолевого эффекта. Впервые продемонстрировано, что СА₂-2 способен в наномолярных концентрациях активировать и поляризовать макрофаги мыши в противоопухолевый M1 фенотип. Использование таких макрофагов приводит к существенному подавлению роста опухолей и значимому увеличению средней продолжительности жизни животных-опухоленосителей при проведении клеточной противоопухолевой иммунотерапии.

Результаты проводимых в лаборатории исследований и последующие доклинические испытания отобранных лидерных соединений, полученных из уникальных наземных растений Дальнего Востока России и биологических ресурсов Мирового океана, а также их синтетических аналогов, могут заложить основу для создания новых отечественных биологически активных добавок, продуктов функционального питания и лекарственных средств.

About the authors

Elena L. Chaykina

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: chaykin.dima@yandex.ru

Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Irina G. Agafonova

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: agafonova@piboc.dvo.ru
ORCID iD: 0000-0002-5587-2610

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Ekaterina А. Yurchenko

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: eyurch@piboc.dvo.ru
ORCID iD: 0000-0001-7737-0980

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Ekaterina А. Chingizova

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: martyyas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0093-5757

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Sergey A. Kozlovskiy

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: sergeimerx@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9961-8350

Junior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Evgeny A. Pislyagin

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: pislyagin@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3558-0821

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Anna L. Burylova

Far Eastern Federal University

Email: anaburylova1@gmail.com

Student

Russian Federation, Vladivostok

Ekaterina S. Menchinskaya

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: ekaterinamenchinskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4027-9064

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Dmitry L. Aminin

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Author for correspondence.
Email: daminin@piboc.dvo.ru
ORCID iD: 0000-0002-1073-4994

Corresponding Member of RAS, Doctor of Sciences in Biology, Head of the Laboratory

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files