INTESTINAL MICROBIOCENOSIS AND CYTOKINE STATUS IN LUNG CANCER PATIENTS RECEIVING CHEMOTHERAPY

Full Text

Сравнительно недавно показано, что микробиота кишечника принимает участие в осуществлении ряда функций, необходимых для человека [1]. Миллионы лет совместной эволюции организма человека и микроорганизмов привели к симбиотическим отношениям, в которых микробиота способствует многим физиологическим процессам макроорганизма, а макроорганизм в свою очередь обеспечивает ниши для выживания микробов [2]. Существуют чёткие доказательства, подтверждающие важную роль микробиоты в развитии и функциональной регуляции иммунной системы кишечника. Показано, что микробиота пищеварительного тракта стимулирует развитие и функционирование иммунной системы слизистых оболочек, в то же время иммунная система слизистых оболочек пищеварительного тракта осуществляет постоянное взаимодействие между макроорганизмом и его микробиотой [3, 4], а иммунные клетки кишечника могут регулировать, в свою очередь состав и функцию микробиоты. Подобное гибкое взаимодействие между хозяином и микробиотой позволяет, в частности, сохранять баланс между мирным мутуализмом и болезнью. Данные, полученные в исследованиях в последние годы, свидетельствуют о том, что различные комменсалы играют уникальную роль в развитии и/или поддержании иммунных популяций кишечника. Кроме того, представители микробиоты способствуют благоприятным иммунным реакциям, таким как развитие устойчивых состояний клеток Th17, индукция или активация Treg и регуляция лимфоидных клеток. С другой стороны, различные бактерии-комменсалы могут по-разному участвовать в регуляции мукозного и системного иммунитета [5-7] - некоторые комменсальные популяции могут стимулировать пагубные иммунные ответы, например, такие, как превращение устойчивых клеток Th17 в патогенные Th17-клетки, способствуя кишечному или системному воспалению [8, 9]. Цитостатические препараты, назначаемые как средство терапии неопластических заболеваний, являются факторами, способными вызывать нарушения состояния микрофлоры организма, а также изменения свойств её отдельных представителей. Отмечено, что биологические характеристики бактерий, выделенных из пищеварительного тракта на фоне введения рассматриваемых лекарственных средств, отличаются от аналогичных свойств бактерий, встречающихся у людей или лабораторных животных, не подвергавшихся воздействию препаратов с цитотоксическими свойствами [10]. Прогнозирование эффектов цитостатических препаратов в отношении микроорганизмов в клинических ситуациях может быть затруднено множественностью факторов, воздействующих на организм пациента. Это указывает на необходимость максимально широкого использования мер микробиологического мониторинга состояния кишечной микрофлоры у пациентов, получающих рассматриваемые препараты, с целью выявления и коррекции микроэкологических нарушений. По-видимому, наиболее целесообразны оценка состояния микробиоты толстой кишки и превентивная коррекция выявленных нарушений ещё до начала цитостатической терапии и возможного повреждения микробиоты желудочно-кишечного тракта, особенно у лиц, имеющих изменения в гастроинтестинальном биотопе в период установления диагноза онкологического заболевания [11, 12]. Согласно данным научных исследований, разные виды/штаммы бактерий, вводимых дополнительно в качестве средства адъювантной терапии, могут оказывать различное влияние на функционирование дендритных клеток и таким образом осуществлять регуляцию первоначальных этапов иммунного ответа. В исследовании Е.А. Корниенко и соавт. [13] показано иммуномодулирующее действие L. rhamnosus GG и Bifidobacterium lactis, которое заключалось в усилении фагоцитарной активности и выработки sIgA, подавлении продукции провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухолей - ФНО) и снижении уровня IgE. В исследованиях F. Yan и соавт. [14] уточнена способность L. rhamnosus GG предотвращать цитокинпродуцированный апоптоз в моделях кишечных клеток через ингибирование ФНО, индуцирующего активность проапоптотического митоген-активного белка. Согласно исследованиям J. Kinross и соавт. [15], штаммы Lactobacillus salivarius АН102, АН103, АН105, АН109 и АН110 оказывают иммуномодулирующее воздействие посредством модулирования уровня цитокинов или посредством антагонистического влияния и удаления провоспалительных или иммуномодулирующих микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта. Bifidobacterium longum и Lactobacillus bulgaris способны подавлять продукцию ИЛ-8 эпителиальными клетками кишечника линии НТ29 и, таким образом, снижать воспалительные реакции в кишечнике. Такие данные позволяют предположить, что введение препаратов, влияющих на микроэкологию кишечника, может способствовать гармонизации кишечной флоры у пациентов, получающих цитостатическую терапию, и оказывать влияние на некоторые параметры иммунитета [11]. Нами проведено исследование, цель которого - изучить клинические и лабораторные особенности микробиоценоза пищеварительного тракта и определить характер изменений цитокинового статуса пациентов с диагнозом рак лёгкого, получающих цитостатическую терапию, и оценить характер влияния адъювантной терапии на динамику изучаемых параметров. В качестве адъювантной терапии использовали сорбционно-метабиотический комплекс (композиция биологически активных метаболитов природного микропродуцента Bacillus subtilis (лизоцим, бактериоцины, каталазы и др.), цеолит, гидролизат соевой муки) по схеме: по две капсулы 2 раза в день, утром и вечером, во время приёма пищи, дополнительно к схемам лечения основного заболевания, в течение 28 дней от начала курса химиотерапии. Материал и методы В исследование включены пациенты (n = 41), получающие первый цикл первой линии химиотерапии по поводу рака лёгкого. В общей группе пациентов мужчин было 24 (58,5%), женщин 17 (41,5%). Средний возраст больных составлял 61,7±6,4 года. Средняя продолжительность заболевания составляла 12,3±8,5 мес. Распределение по гистологическому типу рака определялось следующим образом: преобладал плоскоклеточный рак - 16 (39,0%) пациентов, аденокарцинома - 12 (29,4%) пациентов, мелкоклеточный рак - 9 (21,9%) пациентов, недифференцированный рак - 4 (9,7%) пациента. Согласно распределению по типу роста опухоли, центральный рак выявлен у 29 (70,7%) пациентов, периферический рак - у 12 (29,3%) пациентов. Курс химиотерапии включал препараты платины (карбоплатин в дозе 400 мг/м², цисплатин в дозе 50-100 мг/м²), антиметаболиты - антагонисты фолиевой кислоты (алимпта (пеметрексед) в дозе 500 мг/м²), таксаны растительного происхождения (паклитаксел в дозе 175 мг/м², доцетаксел в дозе 75-100 мг/м²), ингибиторы топоизомеразы (алкалоиды) (этопозид в дозе 50-100 мг/м²/сут, навельбин в дозе 25-30 мг/м²) и преднизолон в стандартных дозах. Продолжительность курса составила 3 дня. Каждому пациенту до и после лечения были проведены следующие исследования: определение цитокинового статуса мультиплексным методом, исследование метаболитов микроорганизмов в крови с помощью метода газожидкостной хроматографии - масс-спектрометрии по методу Г.А. Осипова (была определена концентрация метаболитов широкого спектра микроорганизмов, общая микробная нагрузка и уровень эндотоксинов (липополисахаридов) в плазме крови) [16], микробиологическое исследование фекалий (выделение бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов, кишечных палочек, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, неферментирующих грамотрицательных бактерий, стафилококков, гемолитических форм микроорганизмов, энтерококков и дрожжеподобных грибов рода Candida1. Статистическую обработку данных проводили, используя программу «SPSS Statistics 17.0» (компания «SPSS Inc.», США), критерий Манна-Уитни, Вилкоксона, критерий χ2, t-критерий Стьюдента, метод Фишера [17]. Результаты и обсуждение При оценке иммунологических показателей учитывали провоспалительную (ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО) и противовоспалительную (ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-γ) направленность ответа. Результаты анализа на определение про- и противовоспалительных цитокинов и ИФН-γ в крови больных раком лёгкого представлены в табл. 1. Анализ цитокинового статуса показал, что у пациентов с диагнозом рак лёгкого отмечалось повышение уровня ИЛ-2 (у 100% пациентов), ИЛ-6 (у 92%), ИЛ-8 (у 54%), а повышение уровня ФНОα было отмечено только у 8% пациентов, повышение уровня ИЛ-10 - у 8% пациентов, в то время как уровень остальных цитокинов оставался в пределах референтных интервалов. Таким образом, в результате анализа цитокинового статуса пациентов с диагнозом рак лёгкого отмечено увеличение уровня провоспалительных цитокинов в крови. При этом уровень противовоспалительных цитокинов в крови пациентов не превышал референтные значения. При исследовании состояния кишечного микробиоценоза бактериологическим методом у пациентов с диагнозом рак лёгкого выявлены снижение видового разнообразия микроорганизмов, скудный рост облигатных микроорганизмов в фекалиях и дисбиотические изменения. Выявлено также уменьшение количества бифидобактерий на фоне патологического увеличения количества лактобактерий, практически полное отсутствие бактероидов, уменьшение количества энтерококков, уменьшение количества кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью и увеличение количества кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью, присутствие условно-патогенных и гемолитических микроорганизмов, S. aureus, увеличение количества грибов рода Candida. Частота регистрации изменённых и соответствующих референтным значениям показателей кишечной микрофлоры у пациентов с диагнозом рака лёгкого показана на рис. 1. В результате определения концентрации микробных маркёров клинически значимое снижение уровня метаболитов бифидобактерий обнаружено у 65,5% из числа включённых в исследование пациентов с диагнозом рак лёгкого, а клинически значимое снижение уровня метаболитов лактобактерий - у 79,3%. Общая микробная нагрузка была снижена у 148,3% пациентов. Обращал на себя внимание низкий уровень метаболитов - маркёров микрофлоры кишечника: снижение уровня метаболитов Streptococcus spp. наблюдалось у 69% пациентов, Cl. hystolyticum - у 82,8%, Lactococcus - у 31,0%, Cl. propionicum - у 93,2%, Actinomyces - у 73%, Pseudonocardia - у 87%, Cl. ramosum - у 43%, Alcaligenes - у 20,7%, Staphylococcus intermedius - у 44,8%, Staphylococcus - у 44,8%, Eubacterium - у 41,4%, Enterococcus - у 82,8% пациентов. При этом отмечалось появление в крови метаболитов патогенных микроорганизмов, уровень которых не должен превышать нулевое значение, в том числе Peptostreptococcus anaerobius - у 89,7% пациентов, Pseudomonas aeruginosa - у 24,1%, Fusobacterium/Haemophylus - у 65,5%, Cl. perfringens - у 65,2% , Moraxella/Acinetobacter - у 24,1%, Bacteroides fragilis - у 44,8% пациентов. Распределение включённых в исследование пациентов в зависимости от уровня микробных метаболитов показано на рис. 2. По результатам оценки динамики уровня провоспалительных цитокинов не обнаружено статистически значимых различий между 1-й и 2-й группами, но значимость различий в динамике уровня цитокина ИЛ-6 между группами была близка к критическому уровню (p = 0,076): уровень ИЛ-6 снизился у пациентов 1-й группы и повысился у пациентов 2-й группы. Аналогичная тенденция наблюдалась в отношении динамики уровня ИФН-γ в группах: снижение у пациентов 1-й группы и повышение у пациентов 2-й группы. Характер изменения уровня противовоспалительных цитокинов у пациентов обеих групп практически не различался (табл. 2). Помимо статистического сравнения групп между собой, также было проведено сравнение уровней цитокинов на 1-й и 29-й день наблюдения в каждой из групп по отдельности. Результаты парных сравнений количественных значений в обеих группах наблюдения и основные наблюдаемые тенденции динамики уровня цитокинов представлены в табл. 3. Следует отметить, что у пациентов 1-й группы на фоне метабиотической терапии статистически значимо снизился уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8, в то время как у пациентов 2-й группы статистически значимых изменений уровня цитокинов не наблюдалось, но прослеживалась тенденция к повышению количества ФНОα, уровня ИФН-γ и ИЛ-6. На 29-й день исследования у пациентов, получавших дополнительно к основной терапии метабиотическую поддержку, показатели представителей облигатной микробиоты (лактобактерий и бактероидов) преимущественно оставались на прежнем уровне, но доля пациентов со сниженным количеством бифидобактерий уменьшилась с 57,1 до 42,9%, а доля пациентов с повышенным количеством кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью снизилась с 81,0 до 66,7%. При повторном исследовании фекалий пациентов 2-й группы было выявлено прогрессирующее снижение количества бифидобактерий - с 50 до 65%. Доля пациентов со сниженным количеством кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью практически не изменилась, как и доля пациентов с повышенным количеством кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью. По результатам определения уровня микробных метаболитов в крови на 29-й день от начала приёма метабиотического препарата дополнительно к основным схемам лечения выявлена тенденция к большему снижению общей микробной нагрузки в контрольной группе, в то время как в основной группе она имела тенденцию к повышению. Отмечено, что у пациентов как основной, так и контрольной группы уровень метаболитов бифидобактерий практически не изменился, в то время как в группе контроля наблюдалась тенденция к снижению уровня метаболитов лактобактерий. При парном сравнении значений в 1-й и 29-й день наблюдения отмечалось статистически значимое увеличение количества энтерококков у пациентов 1-й группы (z = -3,211, p = 0,001), в то время как у пациентов 2-й группы статистически значимого увеличения количества энтерококков не наблюдалось. Заключение В результате анализа цитокинового статуса пациентов с диагнозом рак лёгкого отмечено, что на фоне метабиотической терапии снизился уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8, в то время как у пациентов без метабиотической поддержки прослеживалась тенденция к повышению количества ФНОα, ИФН-γ и ИЛ-6 на фоне цитостатической терапии. Однако следует отметить, что полученные данные требуют дальнейшего изучения в связи с недостаточным количеством материала исследования. Результаты микробиологического исследования фекалий и данные, полученные с помощью метода хроматографии - масс-спектрометрии микробных маркёров свидетельствуют о значительном снижении количества облигатных и факультативных представителей микрофлоры кишечника у пациентов с диагнозом рак лёгкого, получающих химиотерапию. При этом имеет место выраженный микроэкологический дисбаланс интестинального биотопа: на фоне выраженного снижения количества облигатных и факультативных представителей микробиоты повышается активность патогенной микрофлоры кишечника. Наиболее часто у пациентов с диагнозом рак лёгкого, получающих химиотерапию, встречалось снижение количества бактероидов и бифидобактерий, снижение количества кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью, увеличение количества кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью, увеличение количества грибов рода Candida. На фоне цитостатической терапии данные изменения усугублялись. Дополнительное назначение метабиотических препаратов позволяло сохранить количество облигатных микроорганизмов кишечника, снижающееся на фоне терапии цитостатиками, и предупредить прогрессирование неблагоприятных изменений качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки у пациентов с диагнозом рак лёгкого.

About the authors

Margarita Yu. Serkova

I.I. Mechnikov North-Western State Medical University

Email: serkova.margarita@yandex.ru
MD, Assistant of the Department of Propaedeutics of Internal Diseases, Gastroenterology and Dietology, Saint-Petersburg, 195067, Russian Federation Saint-Petersburg, 195067, Russian Federation, Russia

E. B Avalueva

I.I. Mechnikov North-Western State Medical University

Saint-Petersburg, 195067, Russian Federation, Russia

I. G Bakulin

I.I. Mechnikov North-Western State Medical University

Saint-Petersburg, 195067, Russian Federation, Russia

S. I Sitkin

I.I. Mechnikov North-Western State Medical University

Saint-Petersburg, 195067, Russian Federation, Russia

References

Supplementary files